Die wissenschaftliche Gemeinschaft hat einen exponentiellen Anstieg der Anwendungen von Graphen und graphenbasierten Materialien in einem breiten Spektrum von Bereichen beobachtet, von der Technik über die Elektronik bis hin zur Biotechnologie und biomedizinischen Anwendungen. Im Bereich der Neurowissenschaften sind diese Materialien in zweierlei Hinsicht von Interesse.

Graphenmaterialien können Nervenzellen beeinflussen

Einerseits können Nanoblätter aus Graphen oder Graphenderivaten (Graphenoxid oder seine reduzierte Form) als Träger für die Verabreichung von Medikamenten verwendet werden. Ein wichtiger Aspekt dabei ist die Bewertung ihrer Toxizität, die stark von der Zusammensetzung der Flocken, ihrer chemischen Funktionalisierung und ihren Abmessungen abhängt. Andererseits kann Graphen auch als Substrat für die Gewebezüchtung genutzt werden. In diesem Fall ist die Leitfähigkeit wahrscheinlich die wichtigste Eigenschaft der verschiedenen Graphen-Materialien, da sie es ermöglichen kann, neuronale Netzwerke zu instruieren und abzufragen sowie neuronales Wachstum und Differenzierung zu fördern, was ein großes Potenzial für die regenerative Medizin birgt. In dieser Übersicht versuchen wir, einen umfassenden Überblick über die Errungenschaften und neuen Herausforderungen in diesem Bereich zu geben und die unserer Meinung nach spannendsten Richtungen für die unmittelbare Zukunft aufzuzeigen.

Dazu gehört die Notwendigkeit, multifunktionale Nanopartikel zu entwickeln, die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, um die Nervenzellen zu erreichen, und die bedarfsgerechte Verabreichung spezifischer Medikamente zu erreichen. Wir beschreiben den Stand der Technik bei der Verwendung von Graphen-Materialien zur Entwicklung dreidimensionaler Gerüste, um das Wachstum und die Regeneration von Neuronen in vivo zu fördern, und die Möglichkeit der Verwendung von Graphen als Bestandteil von hybriden Verbundwerkstoffen/mehrschichtigen organischen Elektronikgeräten. Nicht zuletzt befassen wir uns mit der Notwendigkeit einer genauen theoretischen Modellierung der Schnittstelle zwischen Graphen und biologischem Material, indem wir die Wechselwirkung von Graphen mit Proteinen und Zellmembranen auf der Nanoskala modellieren und die physikalischen Mechanismen des Ladungstransfers beschreiben, durch die die verschiedenen Graphenmaterialien die Erregbarkeit und Physiologie von Nervenzellen beeinflussen können.

Einführung

Graphen (G) ist eine ein- oder mehrlagige Schicht aus Sp2-gebundenen Kohlenstoffatomen, die in einem zweidimensionalen (2D) Wabengitter dicht gepackt ist und eine Dicke von nur 0,34 nm aufweist (Geim, 2009). Jedes Kohlenstoffatom hat drei μ-Bindungen und eine π-Bindung außerhalb der Ebene, die sich mit benachbarten Atomen verbinden kann (Geim, 2009), was G mit einer Dicke von einem Atom zur dünnsten jemals bekannten und stärksten Verbindung macht, die entdeckt wurde.

Darüber hinaus ist sie leicht, flexibel und transparent und sowohl elektrisch als auch thermisch hoch leitfähig, was die Möglichkeit eröffnet, sie in einem breiten Spektrum von Anwendungen einzusetzen, darunter Superkondensatoren (Hess et al., 2011; Sahoo et al., 2015; Casaluci et al., 2016), flexible Elektronik (Eda et al., 2008; Meric et al., 2008), druckbare Tinten (Zhu et al., 2015; Bonaccorso et al., 2016), Batterien (Hassoun et al., 2014; Dufficy et al., 2015), optische und elektrochemische Sensoren (Pumera, 2009; Du et al., 2010; Kang et al, 2010), Energiespeicherung (El-Kady und Kaner, 2013; Bonaccorso et al., 2015; Ambrosi und Pumera, 2016) und Medizin (Novoselov et al., 2012; Casaluci et al., 2016; Kostarelos et al., 2017; Reina et al., 2017).

Zu den G-verwandten Materialien (GRM) gehören ein- und wenigschichtige G (1-10 Schichten; GR), G-Oxid (Einzelschicht, 1: 1 C/O-Verhältnis; GO), reduziertes G-Oxid (rGO), Graphit-Nano- und -Mikroplättchen (mehr als 10 Schichten, aber <100 nm Dicke und durchschnittliche laterale Größe in der Größenordnung von nm bzw. μm), G- und G-Oxid-Quantenpunkte (GQDs bzw. GOQDs) und eine Vielzahl von hybridisierten G-Nanokompositen (Bianco, 2013; Wick et al. , 2014; Cheng et al., 2016). Aufgrund ihrer unterschiedlichen Zusammensetzung und Struktur besitzen diese Verbindungen sehr vielfältige Eigenschaften, die bei der Planung biomedizinischer Anwendungen berücksichtigt werden müssen, da sie völlig unterschiedliche biologische Reaktionen hervorrufen. Daher ist es von grundlegender Bedeutung, die verwendeten GRMs ordnungsgemäß zu identifizieren und zu charakterisieren, um den weit verbreiteten Mangel an Reproduzierbarkeit zu beheben, der biologische Experimente mit G-Materialien beeinträchtigt.

In den letzten Jahren haben biomedizinische Anwendungen von G ein immer größeres Interesse auf sich gezogen, darunter die Verwendung von G und GRMs für Bioelektroden, Bioimaging, die Verabreichung von Medikamenten/Genen/Peptiden, DNA-Sequenzierung auf Nanoporenbasis, Stammzelldifferenzierung und Tissue Engineering (Feng et al., 2013; Yang et al., 2013). Darüber hinaus haben GRM großes Interesse an der Entwicklung von Nanoträgern und Nanoimaging-Tools, zwei- und dreidimensionalen Gewebegerüsten, antibakteriellen Beschichtungen und Biosensoren geweckt (Bitounis et al., 2013; Ding et al., 2015).

Das Interesse an der Verwendung von GRM in der Medizin beruht vor allem auf den außergewöhnlichen Eigenschaften von G, einschließlich seiner mechanischen Eigenschaften, Flexibilität, Transparenz, thermo-elektrischen Leitfähigkeit und guten Biokompatibilität. GRM könnten daher die Einschränkungen von Metallen und Silizium überwinden, die derzeit für implantierbare Geräte verwendet werden, aber durch eine hohe Steifigkeit, ein hohes Entzündungspotenzial und eine schlechte Langzeitstabilität in physiologischer Umgebung gekennzeichnet sind. Darüber hinaus besteht im biomedizinischen Bereich ein großer Bedarf an innovativen Therapien, um der steigenden Nachfrage nach spezifischeren, sichereren und wirksameren Behandlungen für pathologische Zustände gerecht zu werden. In Anbetracht dieser Voraussetzungen konzentriert sich ein großer Teil der Forschung zu G auf medizinische Anwendungen, insbesondere im Bereich der Neurologie, wo seine mechanischen und elektronischen Eigenschaften es zu einem starken Kandidaten für die Ersetzung aktueller Geräte machen (Kostarelos et al., 2017; Reina et al., 2017).

Ein weiterer attraktiver Aspekt von Medizinprodukten auf GRM-Basis sind die zunehmenden Beweise für die Biokompatibilität von G, ein äußerst wichtiger Aspekt, der bei jedem neuen Biomaterial, das auf den Markt gebracht wird, berücksichtigt werden muss. Aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzung ermöglicht die G-Oberfläche starke und zerstörungsfreie Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene, die durch eine spezifische chemische Funktionalisierung noch verbessert werden können (Cheng et al., 2016; Kang et al., 2016). Dies gilt insbesondere für G-basierte Träger und Gerüste, die auf Gewebereparatur und -regeneration ausgerichtet sind, und in der Tat wurden bereits vielversprechende Ergebnisse für neurales und Knochengewebe-Engineering gezeigt (Cheng et al., 2016; Reina et al., 2017).

Bei G-Nanoblattdispersionen, die hauptsächlich für die Verabreichung von Medikamenten/Genen und für die diagnostische Bildgebung bestimmt sind, ist das Szenario hingegen komplexer (Bramini et al., 2016; Mendonça et al., 2016a; Rauti et al., 2016). Die Sicherheit dieses Materials ist in der Tat immer noch ein schwieriges Problem, und jeder Fall muss gesondert analysiert werden, wobei die Synthesemethode, die Qualität des Endprodukts, einschließlich seiner Reinheit und des möglichen Vorhandenseins von Spurenverunreinigungen, sowie die biologische Umgebung, in der G angewendet werden soll, zu berücksichtigen sind.

Graphen-Anwendungen in der Neurowissenschaft

Die biomedizinischen Anwendungen von G sind ein Bereich, der sich ständig weiterentwickelt. Herkömmliche Behandlungsmethoden für Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) stellen eine Reihe von Herausforderungen dar. Daher ist die Entwicklung neuer Instrumente, die den Stand der Technik in den Bereichen Bildgebung, Medikamentenverabreichung, neuronale Regeneration sowie elektrische Aufzeichnung und Sensorik übertreffen, eines der Hauptziele der modernen Medizin und Neurowissenschaft (Baldrighi et al., 2016).

Seit der Entwicklung von kohlenstoffverwandten Materialien hat die Nanotechnologie eine Reihe von Anwendungen stark beeinflusst (Abbildung 1), darunter: Verabreichung von Medikamenten, Genen und Proteinen, um die Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu überwinden und geschädigte Hirnregionen zu erreichen; neuro-regenerative Techniken zur Wiederherstellung der Zell-Zell-Kommunikation nach einer Schädigung durch die Verbindung von zwei- (2D) oder dreidimensionalen (3D) Gerüsten mit Nervenzellen; hochspezifische und zuverlässige Diagnosewerkzeuge für die In-vivo-Erkennung von Krankheits-Biomarkern durch Zellmarkierung und Echtzeit-Überwachung biologisch aktiver Moleküle sowie die Überwachung und Modulation neuronaler Aktivität durch hochempfindliche Elektroden für Aufzeichnungen und G-basierte Plattformen für die elektrische lokale Stimulation (Mattei und Rehman, 2014; John et al. , 2015; Chen et al., 2017; Kostarelos et al., 2017; Reina et al., 2017).

Abbildung 1. Neuronale Schnittstellen auf Graphenbasis für eine Vielzahl von neuronalen Funktionen wie Aufzeichnung, Stimulation und Biosensorik. Modifiziert mit Genehmigung von Kostarelos et al. (2017).

 

Im Einzelnen haben Forscher bereits damit begonnen, den Einsatz von G im ZNS für die Zellmarkierung und die Echtzeit-Überwachung von lebenden Zellen zu erforschen (Wang et al., 2014; Zuccaro et al., 2015); die Lieferung von Molekülen an das Gehirn, die normalerweise von der BHS zurückgewiesen werden (Tonelli et al., 2015; Dong et al., 2016); G-basierte Gerüste für die Zellkultur (Li N. et al., 2013; Menaa et al., 2015; Defterali et al., 2016b); und Zellanalyse auf der Grundlage von G-Elektroden (Medina-Sánchez et al., 2012; Li et al., 2015). Darüber hinaus wurde die Kopplung von G mit Nervenzellen als äußerst vorteilhaft für die Erforschung ihres elektrischen Verhaltens oder die Erleichterung der neuronalen Regeneration durch die Förderung einer kontrollierten Verlängerung der neuronalen Prozesse vorgeschlagen (Li et al., 2011; Tu et al., 2014; Fabbro et al., 2016). Diese Anwendungen eröffnen neue Forschungsmöglichkeiten in der Neurotherapie, einschließlich Neuroonkologie, Neuro-Imaging, Neuro-Regeneration, funktionelle Neurochirurgie und periphere Nervenchirurgie (Mattei und Rehman, 2014).

In dieser Übersicht konzentrieren wir uns auf einige Aspekte der GRM-Forschung, die wir für künftige neurowissenschaftliche Anwendungen für besonders interessant halten, d. h. (i) G als Nanoträger für die Verabreichung von Medikamenten und Genen, (ii) die Wechselwirkung von G mit der BHS und (iii) G-basierte 2D- und 3D-Komposite für die neuronale Regeneration, Stimulation und Aufzeichnung. Ein letztes Kapitel (iv) ist einem Überblick über computergestützte Modellierungsansätze gewidmet, die Biologen und Medizinern helfen können, die molekulare und zelluläre Interaktion von G mit lebenden Systemen besser zu verstehen.

Wie man das Gehirn erreicht: G-basierte Nanocarrier und die Blut-Hirn-Schranke

Interaktion von Graphen-Nanoblättern mit Nervenzellen

Gemeinsame Mechanismen der Zytotoxizität von G-Nanoblättern wurden in der Literatur für verschiedene Zelltypen beschrieben und umfassen die physische Interaktion mit Zellmembranen (Seabra et al., 2014), die Störung des Zellzytoskeletts (Tian et al., 2017), oxidativen Stress durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS; Chen M. et al., 2016; Mittal et al., 2016); mitochondriale Schäden (Pelin et al., 2017); DNA-Schäden wie chromosomale Fragmentierung, DNA-Strangbrüche, Punktmutationen und oxidative DNA-Veränderungen (Akhavan et al., 2012; Fahmi et al., 2017); Autophagie (Chen et al., 2014); und Apoptose und/oder Nekrose (Lim et al., 2016). Darüber hinaus deuten veröffentlichte Daten darauf hin, dass GO weniger toxisch ist als G, rGO und hydriertes G; kleinere Nanoblätter sind weniger toxisch als große Flocken und hoch dispergierbare G-Lösungen sind sicherer als aggregierende (Donaldson et al., 2006; Akhavan et al., 2012; Bianco, 2013; Kurapati et al., 2016; Ou et al., 2016).

Im Falle des ZNS sind die Mechanismen der Interaktion von GRM mit Neuronen und Astrozyten noch wenig erforscht und unklar, was ein unbestimmtes Szenario darstellt, das hauptsächlich von den intrinsischen Eigenschaften der GRM abhängt. Es wurden nur wenige Studien an neuronenähnlichen Zelllinien durchgeführt, die einige toxische Wirkungen von G bei hohen Dosen zeigten. Insbesondere lösten sowohl G als auch Kohlenstoffnanoröhren in PC12-Zellen konzentrations- und formabhängige toxische Reaktionen aus (Zhang et al., 2010). Nach der Exposition mit G wurden ROS erzeugt und bei einer Konzentration von 10 μg/ml wurden Anzeichen von Apoptose festgestellt. In Übereinstimmung mit dieser Studie verursachten GO-Nanoblätter bei niedrigen Konzentrationen keine offensichtliche Zytotoxizität, aber bei der menschlichen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y wurde ein dosis- und zeitabhängiger Zelltod beobachtet (Lv et al., 2012).

Bei Primärkulturen wurden sowohl in vivo als auch in vitro keine Veränderungen der Lebensfähigkeit von Neuronen und Gliazellen nach G-Exposition festgestellt (Bramini et al., 2016; Mendonça et al., 2016b; Rauti et al., 2016). Primäre neuronale Kulturen, die GO-Nanoblättern ausgesetzt waren, zeigten jedoch deutliche Veränderungen in einer Reihe von physiologischen Pfaden, wie Kalzium- und Lipidhomöostase, synaptische Konnektivität und Plastizität (Bramini et al., 2016; Rauti et al., 2016). Nach der Internalisierung in Zellen wurde festgestellt, dass sich G-Nanoblätter bevorzugt in Lysosomen ansammeln und Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum und in einigen Fällen auch Zellkerne physisch schädigen (John et al., 2015).

Eine andere Studie legt nahe, dass die unregelmäßigen Vorsprünge und scharfen Kanten der Nanoblätter die Plasmamembran beschädigen könnten, so dass G in die Zelle eindringen kann, indem es die Phospholipidschicht durchstößt (Li Y. et al., 2013). Diese Merkmale werfen zusätzliche Sicherheitsbedenken auf, da freie GRM im Zytoplasma zu einer Störung des Zytoskeletts, einer Beeinträchtigung der Zellmotilität und einer Blockade des Zellzyklus führen können, ähnlich wie bei der durch Kohlenstoffnanoröhren verursachten Zytotoxizität.

Die oben beschriebenen Wirkungen wurden bei chronischer G-Exposition beobachtet, was die Notwendigkeit einer dringenden und weiterführenden Bewertung der Biokompatibilität des Materials mit Nervengewebe in Langzeitstudien unterstreicht, die hoffentlich die In-vivo-Wirkungen mit den zellulären und molekularen In-vitro-Interaktionen verknüpft. Ein erster deutlicher Hinweis auf eine durch G induzierte ZNS-Toxizität stammt aus einer aktuellen In-vivo-Studie (Ren et al., 2016). Um eine Situation der Umweltverschmutzung durch G zu simulieren, verteilten die Forscher GO in Wasser in Gegenwart von Danio rerio (Zebrabärbling) Larven.

Die exponierten Larven wiesen GO im ZNS auf und, was am wichtigsten ist, eine Induktion von Symptomen, die der Parkinson-Krankheit ähneln, wie z. B. eine Störung der Bewegungsaktivität, den Verlust dopaminerger Neuronen und die Bildung von Lewy-Körpern. Diese Wirkungen waren wahrscheinlich eine Folge der Schädigung der Mitochondrien und der Apoptose über den Caspase-8-Stoffwechselweg bei gleichzeitiger allgemeiner Störung des Stoffwechsels. G- und GO-Nanoblätter reichern sich nach intravenöser (i.v.) Injektion ohne vorherige Oberflächenfunktionalisierung in geringen Mengen im ZNS von Nagetieren an (Mendonça et al., 2016a,b). rGO wurde nach i.v. Injektion, die mit einer Unterbrechung der BHS einherging, auch in Hirngewebe, insbesondere im Thalamus und Hippocampus, nachgewiesen (Mendonça et al., 2016b).

Interessanterweise zeigten Ratten, die mit rGO-Flocken behandelt wurden, keine klinischen Anzeichen von Neurotoxizität, einschließlich keiner Anzeichen von Tremor, Krämpfen, Speichelfluss, Tränenfluss, Dyspnoe und motorischen Abnormitäten. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu der Arbeit von Zhang et al. (2015), die über eine kurzfristige Abnahme der Bewegungsaktivität und der neuromuskulären Koordination bei Mäusen berichteten, denen rGO-Nanoblätter oral verabreicht wurden. Diese Diskrepanz unterstreicht, dass der Verabreichungsweg der Schlüsselparameter für die Biokompatibilität von G ist. Die Eintrittspforte von G in den Organismus wird also zusammen mit seiner Dosis, Größe, Funktionalisierung und Aggregation die endgültigen biologischen Auswirkungen bestimmen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die aktuellen Daten zur Biokompatibilität von G-Nanoblättern immer noch kontrovers sind. Dies ist auf die große Heterogenität der auf dem Markt befindlichen Materialien und die große Vielfalt der Synthesemethoden zurückzuführen. Abhängig von der Graphitquelle (Ausgangsmaterial), der Synthesemethode, der Verwendung von Chemikalien und der Dispersionsform (Lösung oder Pulver) des Endprodukts kann G unterschiedliche Größen, Dicken, chemische Oberflächen und Aggregatzustände aufweisen, die alle in unterschiedlichem Maße seine Interaktion mit biologischen Systemen beeinflussen. Es ist jedoch klar, dass G-Nanoblätter negative Auswirkungen auf die Umwelt und die Gesundheit haben können, was die Debatte über ihre Verwendung als biomedizinische Plattform offen lässt (Bramini et al., 2016; Reina et al., 2017). Bislang werden GO-Nanoblätter aufgrund ihrer größeren Löslichkeit und Stabilität in biologischen Flüssigkeiten für biomedizinische Studien gegenüber reinem G bevorzugt (Chowdhury et al., 2013; Servant et al., 2014a; Reina et al., 2017).

Graphen für die Verabreichung von Biomolekülen an das zentrale Nervensystem

Wie oben erörtert, könnte die Verwendung von G-Nanoblatt-Dispersionen für biomedizinische Anwendungen aufgrund der intrinsischen Eigenschaften des Materials einige unerwünschte Effekte haben. Interessanterweise könnte die Funktionalisierung der G-Oberfläche die meisten dieser Nachteile ausgleichen. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von G-Nanoblättern können auf ein höheres Maß an Biokompatibilität abgestimmt werden. Darüber hinaus können Ladungen über π-π-Stapelwechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen oder hydrophobe Wechselwirkungen geladen werden (Georgakilas et al., 2016), was die attraktive Möglichkeit eröffnet, G als Plattform für die Verabreichung von Biomolekülen zu nutzen, die normalerweise von der BHS zurückgewiesen werden. Die große verfügbare Oberfläche und die Möglichkeit, verschiedene Moleküle an ihre Oberfläche zu konjugieren, machen G zu einem geeigneten Material für die Aufnahme und den Transport von Medikamenten, Genen (einschließlich siRNA und miRNA), Antikörpern und Proteinen (Chen et al., 2013).

Darüber hinaus ist es auch möglich, seine chemische Struktur durch Hinzufügen von funktionellen Gruppen wie Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Alkylhalogen- oder Azidgruppen zu verändern (John et al., 2015). Die Oberflächenfunktionalisierung hat den doppelten Vorteil, dass eine große Menge an Biomolekülen geladen und gezielt an die Zielzellen abgegeben werden kann, während gleichzeitig eine homogenere Verteilung des Materials möglich ist, da reines G stark hydrophob ist und in wässriger Lösung, einschließlich biologischer Flüssigkeiten, die Salze und Proteine enthalten, zur Aggregation neigt (Mattei und Rehman, 2014; John et al., 2015). Außerdem könnten funktionalisierte G-Nanoblätter in systemischen, gezielten und lokalen Verabreichungssystemen eingesetzt werden (Feng et al., 2011; Kim et al., 2011; Liu J. et al., 2013). Somit könnte dieser Ansatz die steigende Nachfrage nach multifunktionalen und vielseitigen medizinischen Plattformen erfüllen.

Aufgrund seiner einzigartigen Fluoreszenz-, Photoakustik- und Magnetresonanzprofile haben mehrere Studien auch die Möglichkeit untersucht, G-basierte Nanopartikel (NPs) einzubauen, um die In-vivo-Visualisierung von Hirntumoren zu verbessern und das Tumor-Targeting molekularer Krebsbekämpfungsstrategien zu verbessern (Kim et al., 2011; Yang et al., 2012; Zhang et al., 2013; Hsieh et al., 2016). Auch in diesem Fall haben In-vivo-Studien gezeigt, dass GO mehr als GR ein gutes Potenzial für diese Anwendungen hat, denn systemisch verabreichtes radioaktiv markiertes GO (188Re-GO) konnte das Gehirnparenchym erreichen, wenn auch nur in einer geringen Menge (0,04 %; Zhang X. et al., 2011).

Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke

Die BHS ist eine der wichtigsten physiologischen Barrieren im Organismus und bildet eine dynamische Schnittstelle, die das Gehirn vom Kreislaufsystem trennt (Pardridge, 2001; Begley, 2004). Die Barriere wird von zerebrovaskulären Endothelzellen gebildet, die von Basallamina und perivaskulären Endfüßen der Astrozyten umgeben sind, die das Barrieresystem mit den Neuronen verbinden (Abbott et al., 2010). Zusammen mit Perizyten und Mikrogliazellen unterstützen die Endothelzellen die Barrierefunktion und regulieren die interzelluläre Signalübertragung, um den Fluss und den Transport zum Gehirn zu steuern (Dohgu et al., 2005; Abbott et al., 2010).

Zusammen mit der Arachnoidea und dem Choroidea-Plexus-Epithel schränkt die BHS den Durchgang verschiedener chemischer Substanzen und Fremdstoffe zwischen dem Blutkreislauf und dem neuronalen Gewebe ein, während sie gleichzeitig den Durchgang von Substanzen und Nährstoffen ermöglicht, die für die Stoffwechselfunktionen wichtig sind, von Sauerstoff bis hin zu verschiedenen Proteinen wie Insulin und Apolipoprotein E (Abbott et al., 2006; Strazielle und Ghersi-Egea, 2013). Ein interessanter Punkt ist, dass sich die Endothelzellen der Hirnkapillaren deutlich von den Endothelzellen in den anderen Körperregionen unterscheiden, da sie eine größere Anzahl von Adhärens- und Tight Junctions zwischen benachbarten Zellen aufweisen, so dass keine interzellulären Fenestrationen existieren (Abbott et al., 2006, 2010). Die Tight Junctions zwischen den Endothelzellen der Hirnkapillaren sind eines der wichtigsten strukturellen und anatomischen Elemente der BHS.

Sie bilden die Hauptbarriere, indem sie die Zellmembranen eng miteinander verbinden und die parazellulären Bewegungen von Wasser, Molekülen, Ionen und anderen Biomolekülen regulieren (Begley und Brightman, 2003; Abbott et al., 2010). Auf der Grundlage dieser Merkmale haben einige Forscher hervorgehoben, dass die Permeabilitätseigenschaften der BHS die Dichtheit der interzellulären Verbindungen zwischen den Endothelzellen der Hirnkapillaren widerspiegeln (Rubin et al., 1991). Mit anderen Worten: Die geringe Durchlässigkeit der BHS wird größtenteils durch enge und adhärente Verbindungen verursacht, die die parazelluläre Passage begrenzen (Wolburg und Lippoldt, 2002). Das Ergebnis ist, dass der meiste molekulare Verkehr gezwungen ist, einen transzellulären Weg über die BHS zu nehmen, anstatt sich parazellulär durch die Verbindungsstellen zu bewegen, wie in den meisten Endothelien (Abbott und Romero, 1996; Wolburg und Lippoldt, 2002; Hawkins et al., 2006).

Bislang wurden mehrere Mechanismen für den Transport über die BHS identifiziert (Abbildung 2), darunter parazelluläre oder transzelluläre Wege, Transportproteine (Carrier), rezeptorvermittelte Transzytose und adsorptive Transzytose (Abbott et al., 2006). Transzytose ist ein Prozess, bei dem Biomoleküle in eine Plasmamembraninvagination eingeschlossen und von einer Seite der polarisierten Zellmonolage zur anderen transportiert werden. Spezifische Proteine wie Insulin und Transferrin werden durch rezeptorvermittelte Endozytose und Transzytose aufgenommen, ein Prozess, der als rezeptorvermittelter Transport bekannt ist (Kreuter et al., 2002; Rip et al., 2009; Ulbrich et al., 2009, 2011).

Native Plasmaproteine, wie z. B. Albumin, werden nur schlecht transportiert, aber die Kationisierung kann ihre Aufnahme durch adsorptiv vermittelte Endozytose und Transzytose erhöhen (Abbott und Romero, 1996; Pardridge, 2007a). Zusätzlich zur Transzytose können sehr kleine wasserlösliche Verbindungen die Tight Junctions über einen parazellulären wässrigen Transportweg durchdringen. Beim parazellulären Transport fungieren die tight junctions als “Gatekeeper” und regulieren die parazelluläre Diffusion wasserlöslicher Stoffe. Saccharose zum Beispiel ist ein wasserlösliches Molekül und kann die BHS in begrenzten Mengen durch parazelluläre Diffusion passieren (Ek et al., 2006).

Die große Lipidmembran-Oberfläche des Endothels bietet auch einen effektiven Diffusionsweg (transzellulärer Transport) für kleine gasförmige Moleküle wie O2 und lipidlösliche Wirkstoffe, darunter Medikamente wie Barbiturate und Ethanol. Das Endothel enthält außerdem Transportproteine für Glukose, Aminosäuren, Purinbasen, Nukleoside, Cholin und andere Substanzen. Einige Transporter, z. B. das P-Glykoprotein, sind energieabhängig und wirken als Efflux-Transporter (Active-Efflux-Transport).

Abbildung 2. Wege durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS). Abgeändert mit Genehmigung von Abbott et al. (2006).

 

Das oben beschriebene komplexe Netz von Transportsystemen verleiht der BHS eine lebenswichtige neuroprotektive Funktion, die jedoch mit einigen Nachteilen verbunden ist, da die BHS auch die Passage von Medikamenten für ZNS-Erkrankungen behindert. Pharmazeutische Unternehmen haben erhebliche Anstrengungen und Summen in die Entwicklung von Medikamenten investiert, die die BHS überwinden können – mit sehr begrenztem Erfolg. Berichten zufolge erreichen nur 5 % der insgesamt für neuronale Erkrankungen entwickelten Medikamente tatsächlich das ZNS (Pardridge, 2007b).

Nanopartikeltechnologie

Das therapeutische Potenzial von NPs hängt hauptsächlich von der Geschwindigkeit der NP-Penetration ab, wenn sie aus der äußeren Umgebung in die inneren Biokompartimente gelangen. Daher sind biologische Barrieren von zentraler Bedeutung für die Bestimmung der biologischen Auswirkungen der NP-Exposition. Nanomaterialien bieten ein enormes Potenzial für Therapeutika und Diagnose, bergen aber auch die Möglichkeit eines unbeabsichtigten Zugangs zum Gehirn (Herda et al., 2014). In-vivo-Studien zeigten, dass NP nach verschiedenen Verabreichungsarten im ZNS gefunden werden können (Semmler-Behnke et al., 2008; Zensi et al., 2009, 2010). Parallel dazu wurden In-vitro-Modelle der menschlichen und murinen BHS für die Untersuchung der Translokation von NP verwendet und entwickelt (Andrieux und Couvreur, 2009; Ragnaill et al., 2011; Bramini et al., 2014; Herda et al., 2014; Raghnaill et al., 2014).

Zahlreiche Nano-Delivery-Systeme wurden für therapeutische Zwecke vorgeschlagen und getestet, sowohl in vitro als auch in vivo (Pandey et al., 2015). Unter den modernen Systemen sind polymere NPs aufgrund ihrer hohen Wirkstoffverkapselungskapazität vielversprechend, da sie hydrophobe Wirkstoffe schützen und transportieren, ohne die Struktur der BHS zu beschädigen (Tosi et al., 2008). Die Bindung von Apolipoprotein E an NPs wurde als ein Mechanismus vorgeschlagen, über den NPs bestehende Wege nutzen könnten, um ins Gehirn zu gelangen (Kreuter et al., 2002; Wagner et al., 2012), und tatsächlich wird dadurch die Aufnahme von Medikamenten verbessert (Michaelis et al., 2006).

Besonders vielversprechend ist dieser Ansatz bei Liposomen, die sehr biokompatibel sind (Re et al., 2011). Im Allgemeinen ist die Ausnutzung der rezeptorvermittelten Transzytose durch Bindung spezifischer Peptide an die NP-Oberfläche das am meisten untersuchte System auf dem Gebiet der BHS-Überquerung gewesen. Verschiedene Moleküle wie Transferrin, Insulin, Lektin und Lipoproteine nutzen physiologischerweise diesen Weg, um aus dem Blutkreislauf ins Gehirn zu gelangen; daher könnten diese Liganden die Durchgangsrate von arzneimittelbeladenen NPs durch die BHS für therapeutische Zwecke erhöhen (Herda et al., 2014; Pandey et al., 2015; Åberg, 2016). Kürzlich wurden auch exogene Peptide, von denen bekannt ist, dass sie in der BHS eine Transzytose durchlaufen, auf die NP-Oberfläche aufgepfropft, um ihren Eintritt in das ZNS zu verbessern. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf den Diphtherietoxin-Rezeptor (DTR) und die Human Immunodeficiency Virus (HIV)-TAT-Proteine gelegt.

Eine Mutante des DTR, die weder toxisch noch immunogen ist, wurde sowohl in vitro als auch in vivo für den Transport von Nanoliposomen und Polybutylcyanoacrylat-NP über die BHS getestet, und tatsächlich waren nur gepfropfte NPs in der Lage, die Barriere zu überwinden (van Rooy et al., 2011; Kuo und Chung, 2012; Kuo und Liu, 2014). Die gleiche Strategie war erfolgreich, wenn ein Derivat des HIV-TAT-Proteins verwendet wurde, das über Polyethylenglykol (PEG)-Moleküle an die Oberfläche von polymeren Mizellen oder SiO2 NPs gebunden war (Liu et al., 2008a,b; Zhao X. et al., 2016). Darüber hinaus wurden Antikörper-gepfropfte NPs synthetisiert, die speziell auf Rezeptoren des vaskulären Endothels des Gehirns abzielen (Loureiro et al., 2014; Saraiva et al., 2016), um die physiologischen Transzytose-Mechanismen der BHS zu nutzen. Auch hier wurden die vielversprechendsten Ergebnisse mit Antikörpern gegen Insulin (Ulbrich et al., 2011), Anti-Transferrin (Clark und Davis, 2015) und Anti-LDL (Kreuter, 2014) erzielt. Obwohl diese jüngsten Entwicklungen im Bereich des Antikörper-Engineerings das Wissen über Therapeutika für das Gehirn verbessert haben, indem sie die Zielgenauigkeit erhöht und den Verlust des Materials in der Peripherie vermieden haben, müssen noch erhebliche Anstrengungen unternommen werden, um diese Erkenntnisse aus der Forschung in klinische Anwendungen zu übertragen.

Eine große Herausforderung bei sphärischen NP besteht darin, dass es schwierig ist, ein multifaktorielles System zu entwickeln, das in der Lage ist, einen Wirkstoff einzukapseln, die BHS durch rezeptorvermittelte Endozytose zu überwinden und schließlich auf eine spezifische zelluläre Subpopulation zu wirken. Obwohl NPs eine große Oberfläche haben, ist der Spielraum für die Entwicklung von Peptiden und Molekülen auf der Oberfläche, um das System in Richtung verschiedener Körperkompartimente zu lenken und zu steuern, immer noch begrenzt. Vor diesem Hintergrund wurden vor kurzem neue Ansätze entwickelt, die eine externe Modulation der Permeabilität der BHS mit der Entwicklung von NP kombinieren.

Tensid-Beschichtung und Hyperthermie

Ein sehr ähnlicher Ansatz wie die oben beschriebene Oberflächenmodifikation von NP mit Liganden besteht in der Beschichtung von NP mit Tensiden (Pardridge, 2012). Diese Strategie führt zu einer vorübergehenden Unterbrechung der tight junctions, was zu einer höheren Permeabilität des Endothels führt, wodurch große Moleküle und Nanoträger die BHS leicht passieren und das Gehirn erreichen können (Pardridge, 2012; Saraiva et al., 2016). Darüber hinaus kann Poly(sorbat 80) Apolipoprotein E und/oder A-I adsorbieren, was den NPs zusätzlich die Fähigkeit verleiht, im Hirnendothel exprimierte Lipoproteinrezeptoren zu binden und die BHS zu passieren (Kreuter et al., 2003; Petri et al., 2007).

In den letzten Jahren hat die Forschung innovative Strategien entwickelt, um die Schädigung der BHS zu verringern und die Menge der in das ZNS transportierten Arzneimittel zu erhöhen. Ein Forschungszweig zielte darauf ab, die Durchlässigkeit der BHS zeit- und gebietsspezifisch zu erhöhen, um die Passage von NP zu erleichtern. Dies wurde beispielsweise durch die Aktivierung des A2A-Adenosinrezeptors erreicht, der den interzellulären Raum zwischen dem Endothel der Hirnkapillaren vergrößert (Gao et al., 2014). Ein ähnlicher Effekt kann durch physische Interaktion mit der BHS erzielt werden, indem eine Hyperthermie induziert wird, ein Verfahren, das die lokale Temperatur des Endothels auf 41-43 °C erhöht.

Die Temperaturveränderung bewirkt eine selektive Unterbrechung der tight junctions und erhöht die parazelluläre Permeabilität der BHS. Interessante Ergebnisse wurden mit fokussiertem Ultraschall (FUS) und Mikroblasen erzielt, die eine sehr geringe Gewebetoxizität und eine hohe Akkumulation von Doxorubicin (DOX) im ZNS zeigten (Treat et al., 2007). Andere Techniken zur Erzeugung von Hyperthermie sind Mikrowellen und Hochfrequenz. Letztere wurde in vivo für die Gliombehandlung in Kombination mit klassischer Chemo- und Strahlentherapie getestet und zeigte ermutigende Ergebnisse (Wang et al., 2012). Schließlich wurden kürzlich zwei fortschrittlichere Strategien zur Induktion von Hyperthermie erprobt: Laserimpulse und magnetische Erwärmung. Ultrakurze Laserpulse im nahen Infrarot (NIR) bewirkten eine Unterbrechung der BHS in ausgewählten Regionen und ermöglichten so die Passage großer Moleküle im Gehirn (Choi et al., 2011). Magnetische NPs (MNPs) wurden stattdessen für die Verabreichung bioaktiver Verbindungen über die durch magnetische Erwärmung erzeugte Wärme unter Verwendung eines schwachen Hochfrequenzfeldes verwendet (Tabatabaei et al., 2015). Da die Lage der MNP auch live überwacht werden kann, kann diese Technik sowohl für die Behandlung als auch für die Diagnose von Krankheiten eingesetzt werden.

Trotz der vielversprechenden Ergebnisse sind Techniken, die die Durchlässigkeit der BHS modulieren und stören, wenn auch nur vorübergehend und lokal, mit einem großen Problem behaftet, nämlich dass die Passage unerwünschter Moleküle und/oder Mikroorganismen, die den Blutstrom bevölkern, nur sehr schlecht kontrolliert werden kann. Wenn es stimmt, dass die Menge an Medikamenten, die das Gehirn erreicht, durch die Öffnung der tight junction erhöht wird, dann stimmt es auch, dass toxische Verbindungen, die durch eine intakte BHS sicher an die Blutgefäße gebunden sind, gleichzeitig passieren können, was ein hohes Risiko für den Patienten darstellt.

Graphen und die BHS: Ein neuer Weg für die Verabreichung von Medikamenten und Genen an das Gehirn

Das Hauptziel eines jeden Systems zur Verabreichung von Arzneimitteln besteht darin, ein intelligentes Werkzeug zu schaffen, das spezifische Ziele erkennt und das Arzneimittel auf kontrollierte Weise freisetzt (Allen und Cullis, 2004). Die Hauptbeschränkung von G-basierten Anwendungen in der Neurowissenschaft ist die sehr geringe Akkumulation im Gehirnparenchym nach intravenöser Injektion. Nach der intravenösen Injektion verbindet sich G mit Ionen, Lipiden und Proteinen, was zur Aggregation des Materials und zur Bildung einer biomolekularen Korona führt, die die Verteilung von G beeinträchtigen und Entzündungsreaktionen auslösen könnte (Dell’Orco et al., 2010). Darüber hinaus können Nanoblätter von Makrophagen phagozytiert werden, was zu einer Aktivierung und Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen führt (Zhou et al., 2012), und mit verschiedenen Blutbestandteilen interagieren, was eine Hämolyse auslöst (Liao et al., 2011). Nicht zuletzt könnten sich G-Nanoblätter im retikulo-endothelialen System anreichern und nicht in dem Gewebe, auf das sie ausgerichtet sind (McCallion et al., 2016).

Eine besondere Herausforderung ist die Passage durch die BHS, die die Verabreichung von Arzneimitteln erheblich einschränkt und etwa 100 % der großmolekularen Neurotherapeutika und mehr als 98 % aller niedermolekularen Arzneimittel blockiert (Upadhyay, 2014). Laut Mendonça et al. (2016b) überwinden systemisch injizierte rGO-Nanoblätter die BHS durch eine vorübergehende Verringerung der parazellulären Dichtigkeit der BHS und reichern sich im Thalamus und Hippocampus von Ratten an. Im Gegensatz dazu führt die Funktionalisierung von rGO mit PEG, die in der Regel zur Verbesserung der Biokompatibilität von Nanomaterialien verwendet wird, zum Zusammenbruch der BHS und zu Funktionsstörungen der Astrozyten in vivo (Mendonça et al., 2016a).

Zu den verschiedenen Ansätzen, um G die BHS zu überwinden, gehörte die Anwendung von Ultraschall bei Mäusen, um die engen Verbindungen der BHS physisch zu öffnen und das Medikamentenabgabesystem in das Gehirn eindringen zu lassen. Mit dieser Methode konnten GO-Nanoblätter, die mit Gd-DTPA und Poly(amidoamin)-Dendrimer gepfropft und mit EPI und dem Tumorsuppressor miRNA Let-7 beladen waren, nach Injektion in die Schwanzvene das Gehirn erreichen (Yang et al., 2014). Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Reversibilität der Öffnung der BHS. Interessanterweise ermöglichte G gleichzeitig eine Hochkontrast-MRT-Analyse und eine Quantifizierung der Verteilung des Verabreichungssystems im Hirngewebe (Yang et al., 2014). Diese Ergebnisse sind vielversprechend, jedoch sind eingehende pharmakokinetische und toxikologische Studien erforderlich, insbesondere für Langzeitbehandlungen, wobei zu berücksichtigen ist, dass diese Technik im Vergleich zu dem, was bisher untersucht wurde, eine viel höhere G-Akkumulation im ZNS erreicht.

Alternativ kann die G-Oberfläche mit spezifischen Biomolekülen funktionalisiert werden, die es dem Material ermöglichen, die BHS zu passieren (Allen und Cullis, 2004; Goenka et al., 2014; John et al., 2015). In einer aktuellen Studie wurde ein innovatives Nano-Delivery-System mit hoher Ladekapazität und pH-abhängigem Verhalten untersucht. Das GO@Fe3O4-Nanokomposit wurde mit Lactoferrin (Lf) konjugiert, einem eisentransportierenden Serumglykoprotein, das an Rezeptoren bindet, die an der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen der BHS und von Gliomzellen überexprimiert sind, um Lf@GO@Fe3O4 zu erhalten. Nach der Beladung der NPs mit DOX, einem Medikament zur Behandlung von Gliomen (Abbildung 3), wurden die NPs intravenös injiziert, und es wurde beobachtet, dass die Partikel vom Blutkreislauf zu den Gliomzellen wanderten (Liu G. et al., 2013).

Die NPs waren im ZNS stärker konzentriert als in anderen Organen, und es wurde eine höhere Effizienz bei der Tumorregression beobachtet als bei den Tieren, denen nur DOX injiziert wurde. Nach einem ähnlichen Ansatz und mit ähnlich vielversprechenden Ergebnissen funktionalisierten Yang L. et al. (2015) PEG-GO-Nanoblätter mit dem Tat-Protein des HIV, wodurch das arzneimittelbeladene PEG-GO-System die BHS durch Transzytose passieren konnte, während das Barriereendothel vollständig erhalten blieb.

Abbildung 3. Transferrin-modifiziertes G-Oxid (GO) für die gezielte Verabreichung von Medikamenten an Gliome. Modifiziert mit Genehmigung von Liu G. et al. (2013).

 

Wie bereits erwähnt, ist eine weitere vielversprechende Strategie zur Überwindung der BHS die Beschichtung der Nanopartikel mit Tensiden (Kreuter et al., 2003; Gelperina et al., 2010). Kanakia et al. (2014) verbesserten den Transport von GO in das ZNS, indem sie die Nanoblätter mit Dextran funktionalisierten; das Material konnte die BHS überwinden und das Gehirn erreichen, ohne toxische Wirkungen zu entfalten. Überraschenderweise stieg die GO-Konzentration im ZNS mit der Zeit an, während sie in anderen Organen fast nicht vorhanden war. Die Studie deutet also auf eine langsame Anreicherung von G im ZNS und eine langfristige Persistenz des Materials hin, was aus Sicht des Arzneimittelabgabesystems ermutigend ist, aber auch Sicherheitsbedenken hinsichtlich der Langzeittoxizität von G-Nanoblättern aufwirft (Baldrighi et al., 2016), ein Thema, das noch bewertet werden muss.

Die Zahl der erfolgreich mit G-Nanoblättern verknüpften Arzneimittel nimmt zu. Liu Z. et al. (2008) zeigten, dass GO-PEG-Flocken über nicht-kovalente van-der-Waals-Wechselwirkungen mit dem wasserunlöslichen aromatischen Molekül 7-Ethyl-10-hydroxy-Camptothecin (SN38) dekoriert werden konnten. In ähnlicher Weise wurden auch andere Arzneimittel, darunter verschiedene Camptothecin-Analoga (Liu Z. et al., 2008), Iressa (Gefitinib; Liu Z. et al., 2008) und DOX (Sun et al., 2008), durch einfache nicht-kovalente Bindung erfolgreich an den GO-PEG-Komplex gebunden. rGO-PEG-Partikel konnten sowohl in In-vitro- als auch in In-vivo-Studien die Endothelschicht der BHS durchqueren, ohne die tight junctions zu unterbrechen (Mendonça et al., 2016a,b). Kürzlich verwendeten Xiao et al. (2016) GQDs, die mit einem neuroprotektiven Peptid konjugiert waren. Nach intravenöser Injektion in ein Mäusemodell der Alzheimer-Krankheit waren sie in der Lage, die Lern- und Gedächtnisleistung sowie die Bildung dendritischer Stacheln zu verbessern und den Gehalt an proinflammatorischen Zytokinen zu senken.

Eine der Hauptanwendungen für G-basierte Arzneimittelabgabesysteme ist die Krebstherapie, indem G-Komposite mit Chemotherapeutika verbunden werden. Aufgrund ihrer starken optischen Absorption im NIR-Bereich werden G-basierte Hybridmaterialien auch intensiv für ihre vielversprechenden Anwendungen in der Krebs-Phototherapie untersucht (Liu et al., 2011; Robinson et al., 2011; Yang et al., 2012; Hönigsmann, 2013). Das Grundprinzip dieses Ansatzes besteht darin, die Wärme, die durch das in den Tumorregionen bei NIR-Laseranregung akkumulierte G erzeugt wird, zum Abtöten von Krebszellen zu nutzen. Diese Technik wurde erfolgreich in vitro mit U251-Gliomzellen angewandt (Markovic et al., 2011). Solche experimentellen Ansätze sind von besonderem Interesse, da sie dazu beitragen könnten, die durch die BHS auferlegten Beschränkungen zu überwinden (Abbott, 2013), und sind insbesondere für die Behandlung von sehr resistenten und aggressiven Tumoren, wie dem Glioblastom, sehr vielversprechend.

Die intrinsischen Eigenschaften von G im sichtbaren (VIS) und NIR-Bereich machen sie auch zu einem attraktiven Instrument für das Bio-Imaging (Zhang et al., 2013) sowohl in vitro als auch in vivo (Gollavelli und Ling, 2012). So wurden beispielsweise Aptamer-Carboxyfluorescein/GO-Komplexe für die intrazelluläre Überwachung und das molekulare Sondieren spezifischer Cluster lebender Zellen, z. B. künstlich implantierter Tumore in Mäusen, in situ eingesetzt. GO-Nanoblätter wurden auch für die photoakustische Bildgebung verwendet, die auf der akustischen Reaktion auf die Wärmeausdehnung nach Absorption optischer Energie beruht (Wang et al., 2010; Yang et al., 2010; Qian et al., 2012). Speziell für Anwendungen im ZNS haben In-vivo-Studien gezeigt, dass intrakraniell verabreichtes PEG-GO und seine Derivate durch Zwei-Photonen-Mikroskopie im Gehirn abgebildet werden können (Qian et al., 2012).

Durch diese Bildgebungstechnik kann aufgrund der hohen Gewebedurchdringung des Fluoreszenzsignals von PEG-GO-Kompositen eine 3D-Verteilungskarte im Gehirnparenchym rekonstruiert werden. Diese vielversprechenden Ergebnisse könnten dazu führen, dass G als Diagnoseinstrument für die Bildgebung von Hirntumorläsionen eingesetzt wird, insbesondere wenn das Material mit Biomolekülen versehen wird, die speziell auf tumorbildende Zellen abzielen. Darüber hinaus können die Eigenschaften von G je nach Anwendung optimiert werden, d. h. die Größe und der Oxidationszustand könnten verändert werden, um die Emissionswellenlänge vom VIS in den NIR-Bereich zu verlagern, der eine tiefere Gewebepenetration ermöglicht, wodurch sich die Tiefenwirkung des diagnostischen Bildgebungsgeräts verbessert. Durch die Kombination der optischen Eigenschaften von G mit anderen biologisch abbaubaren und funktionellen Materialien wird es möglich sein, Komposite und Hybride auf G-Basis zu schaffen, die sich für verschiedene Live-Imaging-Anwendungen eignen. Bisher wurden die meisten Instrumente in vitro an Krebszelllinien und in vivo für die Krebserkennung und -diagnose getestet, wobei die Möglichkeit, sie für die Erforschung und Abbildung des ZNS zu verwenden, unberücksichtigt blieb (Zhang et al., 2013; Cheng et al., 2016).

Ähnlich wie bei der Verabreichung von Arzneimitteln kann auch die Gentechnik die G-Eigenschaften nutzen und neue Möglichkeiten in der Biomedizin eröffnen. Das Konzept besteht in diesem Fall darin, Nukleinsäuren, d. h. DNA oder verschiedene Arten von RNA-Molekülen, einschließlich miRNA und shRNA, an bestimmte Zielzellpopulationen zu liefern, um physiologische Bedingungen wiederherzustellen (Cheng et al., 2016). Die Entwicklung nicht-viraler Systeme ist für künftige medizinische Ansätze von großer Bedeutung, da G es ermöglichen könnte, einige der inhärenten Beschränkungen viraler Systeme zu überwinden, wie z. B. Schwierigkeiten bei der Unterbringung langer Nukleinsäuren, Schwankungen von Charge zu Charge, erhöhte Kosten und die Immunogenität viraler Vektorsysteme (Kim et al., 2011; John et al., 2015). Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, darunter die Dekoration mit positiv geladenen Polymeren (PEI, BPEI), Dendrimeren (PAMAM) und Polysacchariden, die die Effizienz der Gentransfektion durch Förderung der Interaktion mit der Zellmembran erhöhen (Liu et al., 2014; Paul et al., 2014).

Da die Technik der Funktionalisierung dieselbe ist, können mit G-basierten Hybridmaterialien sowohl Medikamente als auch Gene gleichzeitig übertragen werden (Zhang L. et al., 2011). Dies hätte einen Synergieeffekt zur Folge, da sowohl die Effizienz des Medikaments als auch die der Transfektion erheblich gesteigert würde. Auf dieser Linie wurden G-Nanoblätter mit dem kationischen Polymer PEI funktionalisiert, einem nicht-viralen Genvektor, der starke elektrostatische Wechselwirkungen mit den negativ geladenen Phosphatgruppen sowohl der RNA als auch der DNA eingeht (Feng et al., 2011). Einen Schritt weiter gingen Chen et al. (2011), die PEI-funktionalisierte GO für die Genübertragung verwendeten und eine hohe Transfektionseffizienz ohne zytotoxische Wirkung erzielten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass G-basierte Abgabesysteme, wenn sie in geeigneter Weise funktionalisiert oder mit ergänzenden Technologien kombiniert werden, vielversprechende Kandidaten für neurowissenschaftliche Anwendungen sowohl in der Diagnostik (z. B. Bildgebung) als auch in der Therapie (z. B. Arzneimittel- und Gentransport) darstellen. Trotz einiger weniger Studien, die toxische Auswirkungen der Exposition des Nervensystems gegenüber blankem G und rGO zeigen (Bramini et al., 2016; Mendonça et al., 2016b; Rauti et al., 2016), gibt es bisher keine soliden Beweise dafür, dass funktionalisiertes G schädlich für neuronale Zellen und die BHS ist. Da sich G-basierte Technologien für biomedizinische Anwendungen ständig und schnell weiterentwickeln, könnten in naher Zukunft neue sichere und hoch neurokompatible Materialien entwickelt werden.

Graphen-Substrate als neuronale Grenzflächen

Ziel des Tissue Engineering ist die Wiederherstellung der Funktionalität eines geschädigten Gewebes durch die Verbindung mit geeigneten Biomaterialien. Dies ist ein schnell wachsendes Forschungsgebiet, in dem innovative Ansätze benötigt werden, um hochgradig biokompatible, funktionelle und wenig invasive Implantate für Langzeitanwendungen zu entwickeln. Für das Nervensystem sind aktive und dynamische implantierbare Geräte äußerst vorteilhaft, da sie die gleichzeitige Stimulation und Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von Nervenzellen ermöglichen. Es wurden verschiedene Arten von implantierbaren Geräten entwickelt, die als neuronale Schnittstellen verwendet werden können.

Dazu gehören Implantate zur Tiefenhirnstimulation (DBI) für die elektrische Stimulation tiefer Strukturen im ZNS, die klinisch zur Behandlung von Dystonie und Tremor bei der Parkinson-Krankheit eingesetzt werden (Perlmutter und Mink, 2006), Retina- und Cochlea-Implantate zur elektrischen Stimulation der überlebenden Neuronen bei Netzhautdegeneration oder zur Umwandlung von externen Geräuschen in elektrische Impulse (Spelman, 2006; Picaud und Sahel, 2014), Stimulatoren für das zentrale und periphere Nervensystem zur motorischen Rehabilitation nach Rückenmarksläsionen (Hatsopoulos und Donoghue, 2009) und intrakranielle Elektroden zur Abbildung der elektrischen Aktivität des Gehirns zu diagnostischen Zwecken (Chang, 2015).

Die intrinsischen Eigenschaften von G können genutzt werden, um G-basierte Geräte für neuronale Schnittstellen zu entwickeln, da G die optischen, elektrischen und mechanischen Eigenschaften von zusammengesetzten Nanostrukturen verbessern kann. Im Allgemeinen sind die grundlegenden Anforderungen an ein gutes neuronales Implantat eine gute Biokompatibilität in Verbindung mit einer minimalen Entzündungsreaktion, ein angemessenes Signal-Rausch-Verhältnis, wenn neuronale Aufzeichnungen geplant sind, und eine minimale Invasivität, bei der die Integrität des implantierten Gewebes erhalten bleibt. Typischerweise können G-basierte Gerüste nach ihrer Dimensionalität klassifiziert werden, d. h. eindimensional (Fasern, Bänder oder Garne), zweidimensional (Papiere, Filme) und dreidimensional (Cheng et al., 2016; Reina et al., 2017). Zu den häufigsten Anwendungen von G-basierten Strukturen in der Nanomedizin gehören die Entwicklung von Gerüsten für die in vivo Regeneration, Stimulation und Aufzeichnung von Neuronen sowie für die bedarfsgerechte Verabreichung von Medikamenten (Cong et al., 2014; Cheng et al., 2016).

Was In-vivo-Anwendungen betrifft, so ist die Verwendung von 2D-Geräten meist auf planare Elektroden beschränkt (Liu et al., 2016; Park et al., 2018). Tatsächlich wurden mehrere G-basierte 2D-Geräte entwickelt, aber aufgrund technischer Einschränkungen wurden sie bisher hauptsächlich in vitro getestet (für eine umfassende Übersicht über 2D-G-basierte Substrate, die auf neuronale Zellen angewendet werden, siehe (Bramini et al., 2018). Vielversprechende In-vitro-Ergebnisse wurden kürzlich von Defterali et al. (2016a) erzielt. Unbeschichtete thermisch reduzierte Graphen-Substrate (TRG) wurden für das Wachstum und die Differenzierung neuronaler Stammzellen (NSCs) verwendet, die direkt auf dem G-Material ohne vorherige Beschichtung mit Biomolekülen wuchsen. Kulturen, die auf TRG-Substraten gezüchtet wurden, zeichneten sich im Vergleich zu Kulturen, die auf Kohlenstoffnanoröhrchen-Substraten gezüchtet wurden, durch eine höhere Zellzahl und mehr synaptische Boutons sowie durch eine effiziente Differenzierung in mehreren Entwicklungslinien aus, was auf eine mögliche Verwendung von G zur Untersuchung funktioneller neuronaler Netzwerke hindeutet.

Im Falle von CVD-G ist der begrenzende Schritt hingegen die Übertragung der Monolayer-G auf das endgültige Substrat, ein Prozess, der häufig Verunreinigungen und Defekte in der G-Struktur verursacht. Außerdem muss noch ein geeignetes Substrat gefunden werden, das die chemisch-physikalischen Eigenschaften von G so wenig wie möglich beeinträchtigt. Darüber hinaus waren 2D-Geräte in vitro mit neuronalen Stammzellen weniger aktiv als 3D-Gerüste mit der gleichen Oberflächenchemie (Jiang et al., 2016), was eindeutig darauf hinweist, dass Morphologie, Dimensionalität, Zugänglichkeit und Porosität kritische Gerüstmerkmale sind. In der Tat sind Schäume und Hydrogele die Gerüste der Wahl, um die Regeneration im Gehirn voranzutreiben, während gerichtete Conduits bevorzugt werden, um das Nachwachsen von peripheren Nerven zu fördern. Im nächsten Abschnitt werden wir die neuesten Entwicklungen bei der Verwendung von 3D-G-basierten Gerüsten in der Neurowissenschaft erörtern, wobei wir uns auf die Verbindung zwischen dem G-Gehalt und der Struktur des Geräts und seiner Funktionalität konzentrieren.

3D G-basierte Scaffolds: Verbundwerkstoffe, Schäume, Fasern und Hydrogele

Anwendungen von G-basierten Materialien im Bereich der Neurologie werden nur möglich sein, wenn dreidimensionale Gerüste entwickelt werden, die die Nervenregeneration an der verletzten/gelässten Stelle unterstützen können. Die einzigartigen Eigenschaften von planaren 2D-G-Gerüsten werden von 3D-G-Strukturen übertroffen, die eine Mikroumgebung bieten, in der Zellen unter Bedingungen wachsen können, die der In-vivo-Situation näher kommen. Darüber hinaus besitzen 3D-Strukturen, wie bereits erwähnt, eine enorme Grenzfläche und bieten hoch leitfähige Pfade für den Ladungstransport, die für die Bildung neuronaler Netzwerke und die neuronale Regeneration nützlich sind.

Es wurden bereits mehrere 3D-Gerüste hergestellt und in vitro getestet, aber bisher wurde nur eine sehr begrenzte Anzahl von ihnen auch in vivo implantiert (Abbildung 4). Einige Beispiele sind G-beschichtete elektrogesponnene PCL-Mikrofasergerüste, die in das Striatum oder die subventrikuläre Zone von erwachsenen Ratten implantiert wurden. G-beschichtete Implantate wurden mit einer geringeren Mikroglia-/Makrophageninfiltration im Vergleich zu nackten Gerüsten in Verbindung gebracht, während die Migration von Astrozyten und Neuroblasten aus der SVZ unterstützt wurde (Zhou et al., 2016). Freistehende poröse 3D-GO-Gerüste wurden in das verletzte Ratten-Rückenmark implantiert und zeigten keine lokale oder systemische Toxizität und eine gute Biokompatibilität auch bei chronischer Implantation (López-Dolado et al., 2015).

Bemerkenswert ist, dass Langzeitimplantate (30 Tage) die Angiogenese und eine teilweise axonale Regeneration fördern konnten (López-Dolado et al., 2016). Bisher wurden keine Versuche unternommen, G-basierte Materialien zur Regeneration des peripheren Nervensystems einzusetzen. Ein erster Schritt in diese Richtung ist die Entwicklung von Nanofasermembranen aus G-Seidenfibroin-Verbundstoffen. Dieses Verbundmaterial ist von Interesse, da es die elektrische Leitfähigkeit und mechanische Festigkeit von G mit der guten Kompatibilität von Seide verbindet. Obwohl sie nicht in vivo getestet wurden, unterstützen G-Seide-Membranen das Wachstum von Schwann-Zellen in vitro (Zhao et al., 2017).

Abbildung 4. 3D G-Scaffolds in vitro und in vivo. (A) (a) REM-Bilder von neuralen Stammzellen (NSCs), die auf 3D-G-Schäumen unter Proliferationsbedingungen kultiviert wurden. Die Einschübe veranschaulichen die Interaktion zwischen den Zellfilopodien und der Oberfläche. (b) Fluoreszenzbilder von NSCs, die 5 Tage lang auf 3D-G-Schaumstoffen kultiviert wurden. Nestin (grün) ist ein Marker für NSCs, und DAPI (blau) kennzeichnet Zellkerne. Modifiziert mit Genehmigung von Li N. et al. (2013). (B) (a,b) Interaktion zwischen Astrozyten und Scaffolds im Gehirn und Infiltration von Astrozytenprozessen 3 Wochen nach Implantation des Scaffolds. Grün: GFAP-positive Astrozyten, blau: DAPI-gefärbte Zellkerne, rot: oberflächenfunktionalisierte Scaffolds. (b) Detaillierte Astrozytenmorphologie des in (a) markierten Bereichs mit Strichkästchen. *Die Astrozyten überbrücken eine Lücke zwischen zwei Gerüstschichten. Maßstabsbalken, 50 (a) und 20 (b) μm. Modifiziert mit Genehmigung von Zhou et al. (2016).

 

Verschiedene dreidimensionale G- und GO-Schäume haben sich als kompatible Substrate für Stammzellen erwiesen (Crowder et al., 2013; Li N. et al., 2013; Serrano et al., 2014; Guo et al., 2016; Sayyar et al., 2016). Li N. et al. (2013) beschrieben erstmals 3D-G-basierte Schäume (3D-GFs) als geeignetes Gerüst für das Wachstum und die Proliferation von NSCs. Auf 3D-GFs gewachsene NSCs waren in der Lage, sich in Neuronen und Astrozyten zu differenzieren; außerdem wurde festgestellt, dass 3D-GFs optimale Plattformen für die elektrische Stimulation von NSCs sind, um ihre Differenzierung zu fördern. Ähnliche Ergebnisse wurden kürzlich mit rGO-Mikrofasern erzielt, die die Lebensfähigkeit von NSCs unterstützen und sie zu einem neuronalen Phänotyp führen können (Guo et al., 2017).

Interessanterweise wirkten sich die Eigenschaften der G-Scaffolds (d. h. steif bzw. weich) unterschiedlich auf die Zelladhäsion und -proliferation aus und konnten die Differenzierung der NSC in Richtung Astrozyten bzw. Neuronen vorantreiben (Ma et al., 2016). Hippocampus-Neuronen, die auf 3D-GFs kultiviert werden, zeichnen sich durch eine umfangreichere Konnektivität aus, die mit einer höheren Netzwerksynchronisation im Vergleich zu 2D-G-Substraten einhergeht und somit die physiologischen Eigenschaften des Gehirns besser nachahmt (Ulloa Severino et al., 2016). Mikrogliazellen wurden auch auf 3D-G-Schäumen gezüchtet. In diesem Fall wirkte sich die 3D-Struktur der Gerüste auf die neuroinflammatorische Reaktion der kultivierten Zellen aus, wahrscheinlich aufgrund räumlicher Beschränkungen durch die 3D-Topografie (Song et al., 2014). Ähnlich wie bei den 2D-Materialien wurden auch 3D-G/GO-Gerüste als zellstimulierende Elektroden verwendet, um das neuronale Wachstum und die Differenzierung von NSCs zu fördern (Li N. et al., 2013; Akhavan et al., 2016).

Es wird auch eine neue Generation von elektrosensiblen 3D-G-Gerüsten entwickelt, d. h. G-basierte Hydrogele, die weiches Gewebe nachahmen und für die kontrollierte, durch Stimulation ausgelöste Freisetzung von Medikamenten vorgeschlagen wurden. Hybride Hydrogele auf G-Basis werden hauptsächlich unter Verwendung von GO, G-Oxidperoxid (GOP) oder rGO synthetisiert, indem sehr geringe Mengen des Materials in eine Hydrogelmatrix eingearbeitet werden, um deren elektrische, mechanische und thermische Eigenschaften zu verbessern (Servant et al., 2014b). Solche Materialien sind in der Lage, das neuronale Wachstum und die Entwicklung der synaptischen Aktivität zu unterstützen (Martín et al., 2017). Nach einem ähnlichen Ansatz wurde Dexamethason, ein Kortikosteroidmedikament, auf Poly(milch-co-glykolsäure)-NP geladen, die anschließend in Alginat-Hydrogelen eingesetzt wurden. Der fertige Verbundstoff wurde als Beschichtung von Gold- und Iridiumelektroden für die lokale Verabreichung von Medikamenten nach der Implantation verwendet (Kim et al., 2004; Kim und Martin, 2006). Diese oder ähnliche Strategien könnten eingesetzt werden, um intelligente Beschichtungen für neuronale Implantate zu entwickeln, mit dem Ziel, biologisch aktive Moleküle durch kontrollierte elektrische Stimuli freizusetzen und gleichzeitig die Oberflächenweichheit und die Biokompatibilität der Implantate zu verbessern.

Insgesamt ist die Verwendung von G-Materialien in 3D-Implantaten für neurowissenschaftliche Anwendungen noch begrenzt. Es gibt jedoch viel von anderen Bereichen der Biomedizin zu lernen. So wurden beispielsweise kürzlich G-Hydrogele und Schäume für die Krebstherapie (Xu et al., 2017; Zhang et al., 2017) sowie für die gesteuerte Regeneration von Knochen (Lu et al., 2016), Knorpel (Nieto et al., 2015) und Muskeln (Mahmoudifard et al., 2016) vorgeschlagen. Wir gehen davon aus, dass die gegenseitige Befruchtung zwischen diesen verschiedenen Disziplinen in naher Zukunft zur Entwicklung funktioneller 3D-Implantate auf G-Basis für Anwendungen im Nervensystem führen wird.

Graphen-basierte Geräte für neuronale Aufzeichnung und Stimulation

Klinische Interventionen zur Heilung von neuralen Funktionsstörungen und motorischen Störungen ziehen die Forschung in Richtung implantierbarer Stimulationsgeräte an, die sich an flexible Träger anpassen und möglicherweise die gängigsten Technologien auf Metallelektrodenbasis übertreffen können. Polymere Schnittstellen sind in Bezug auf die mechanische Nachgiebigkeit besser, aber es fehlt ihnen oft an Haltbarkeit unter physiologischen Bedingungen und vor allem an der richtigen elektrischen Leitfähigkeit. Die meisten neuronalen Stimulationen, die bisher mit G-basierten Elektroden in Kontakt mit lebenden neuronalen Geweben oder Zellen durchgeführt wurden, beschränkten sich auf die Modulation ihres Wachstums und/oder ihrer Differenzierung (Thompson et al., 2015).

Neuronale Stimulationstechniken, wie die tiefe Hirn- oder Kortikalstimulation, Cochlea- und Retina-Implantate, beruhen in der Regel auf der Fähigkeit der implantierten Geräte, eine funktionelle Reaktion des Gewebes durch eine minimale injizierte Ladung hervorzurufen, und erfordern daher Elektroden (Kostarelos et al., 2017). Bislang zeigen In-vivo-Studien, dass G-Elektroden neuronale Aktivität stimulieren und aufzeichnen können. G-Elektroden erzeugen etwas höhere Werte der Ladungsinjektion als herkömmliche Edelmetallelektroden wie Pt oder Au. Neue vielversprechende Materialien und Verbindungen nutzen G, um Ladungsinjektionswerte von bis zu zehn mC cm-2 zu erreichen, wie im Fall einer In-vivo-Sonde aus laserreduziertem GO, eingebettet in Parylen-C (Apollo et al., 2015). Die Autoren verwenden die neuartigen flexiblen, freistehenden Elektroden sowohl zur Stimulation retinaler Ganglienzellen ex vivo als auch zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität in vivo im visuellen Kortex der Katze.

Dies ist einer der wenigen berichteten Belege für die neurale Stimulation mit einem G-basierten Gerät. Andere interessante Anwendungen nutzen mit CVD-G verkapselte Kupfer-Mikrodrähte für ein MRT-kompatibles neuronales Gerät (Zhao Y. et al., 2016) oder flexible G-Mikrotransistoren für die Kartierung der Hirnaktivität (Blaschke et al., 2016), um nur einige zu nennen, beschränken sich aber immer noch auf die Aufzeichnung neuronaler Aktivität in vivo. Darüber hinaus entwickelten Kuzum et al. (2014) eine flexible, rauscharme G-Elektrode für die gleichzeitige elektrophysiologische und bildgebende Aufzeichnung in vivo. Nach der Injektion von Bicucullin zur Hervorrufung epileptiformer Aktivität konnten mit G-Elektroden und Au-Elektroden der gleichen Größe gleichzeitig Aufnahmen aus den kortikalen Hemisphären von Ratten gemacht werden. Die G-Elektroden wiesen im Vergleich zu Au-Elektroden ein sechsmal geringeres Signal-Rausch-Verhältnis auf, was darauf hindeutet, dass die Verwendung des neuen G-basierten Aufzeichnungssystems eindeutige Vorteile für die Untersuchung der elektrischen Aktivität des Gehirns bieten könnte (Abbildung 5). Darüber hinaus war es dank der Transparenz der G-Elektroden möglich, den kortikalen Bereich abzubilden, indem in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung und kortikale elektrophysiologische Aufzeichnung kombiniert wurden (Kuzum et al., 2014).

Abbildung 5. Graphenelektroden für In-vivo-Aufzeichnungen. (A) (a) Schematische Darstellung eines flexiblen neuralen G-Elektroden-Arrays. (b) Foto eines transparenten Arrays mit 16 Elektroden. Die Elektrodengröße beträgt 300 × 300 μm2. (B) (a) Foto einer 50 × 50 μm2 großen Einzel-G-Elektrode auf der kortikalen Oberfläche der linken Hemisphäre und einer 500 × 500 μm2 großen Einzel-Au-Elektrode auf der kortikalen Oberfläche der rechten Hemisphäre. (b) Interiktal-ähnliche Spiking-Aktivität, aufgezeichnet mit 50 × 50 μm2 dotierten G- und Au-Elektroden. Aufzeichnungen mit dotierten G-Elektroden sind fünf- bis sechsmal weniger verrauscht als Aufzeichnungen mit Au-Elektroden gleicher Größe. Modifiziert mit Genehmigung von Kuzum et al. (2014).

 

Ein weiterer Fortschritt wurde durch die Entwicklung von G-Feldeffekttransistoren (G-FETs) erzielt, die eine Signalverstärkung ermöglichen und das externe Rauschen reduzieren (Veliev et al., 2017). Flexible Superkondensatoren auf G-Basis zeigten kürzlich ihr Potenzial für die Nervenstimulation dank ihrer verbesserten Doppelschichtkapazität, wenn sie mit polymeren Materialien wie PEDOT:PSS und rGO, G-Polyanilin-Nanokompositen oder CVD-GO-Schäumen hybridisiert werden (Yang W. et al., 2015; Hu et al., 2016). Eine weitere Möglichkeit, G in biomedizinischen Anwendungen zu nutzen, besteht darin, die optoelektronischen Eigenschaften lichtempfindlicher neuronaler Schnittstellen zu verbessern, die zur Wiederherstellung der Sehkraft eingesetzt werden. Ein Polyimid-Array von Photodetektoren auf der Basis von MoS2 und Tintenstrahl-G wurde kürzlich als flexible Netzhautprothese vorgeschlagen und in vitro auf Biokompatibilität getestet (Hossain et al., 2017). Die meisten dieser Bemühungen müssen jedoch noch in brauchbare Elektroden für neurowissenschaftliche Anwendungen umgesetzt werden.

Computergestützte Modellierung und Simulationen von mit Graphen interagierenden biomolekularen Systemen

Das Verständnis der feinen strukturellen Details, die den Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen und anorganischen Oberflächen zugrunde liegen, ist für viele Anwendungen in der Nanomedizin von zentraler Bedeutung. Obwohl vor kurzem relevante experimentelle Ergebnisse über die Dynamik dieser Wechselwirkungen berichtet wurden, sind viele topologische Details nach wie vor unklar, insbesondere bei den ersten Ereignissen auf ns bis μs Zeitskalen. Um diese Lücke zu schließen, leistet der Einsatz von Computermodellierung und Molekulardynamiksimulationen (MD) einen wichtigen Beitrag und liefert Details, die mit experimentellen Techniken nicht zugänglich sind (Ozboyaci et al., 2016).

Mit seinen vielversprechenden Eigenschaften hat G ein großes Potenzial für verschiedene Anwendungen gezeigt, und die Zahl der computergestützten Studien, die ihm gewidmet sind, wächst ständig (Cavallucci et al., 2016). Klassische MD-Simulationen (d. h. auf der Grundlage einer klassischen physikalischen Beschreibung von Atom-Atom-Wechselwirkungen) haben in den letzten Jahren eine große Anzahl von Ergebnissen über die Wechselwirkung zwischen G-basierten Materialien und Biomolekülen hervorgebracht. Diese Studien ermöglichten es insbesondere, G als Substrat oder Nanopore für die Ablagerung von Biomolekülen eingehend zu charakterisieren und das Verhalten von ursprünglichem G von dem von GO zu unterscheiden. Darüber hinaus wurden MD-Simulationen in großem Umfang eingesetzt, um die Biokompatibilität von G zu testen, indem seine Wechselwirkung mit verschiedenen biologischen Strukturen wie Membranen und Proteinkomplexen untersucht wurde. In diesen Studien wurde G als vielversprechender Vektor gegen bakterielle Erreger und als ein Material beschrieben, das biologische Komplexe stören kann.

Das wichtigste Problem bei klassischen Simulationen dieser Systeme, das derzeit noch diskutiert wird, ist die Definition eines geeigneten Satzes von Kraftfeldparametern für G, um die Durchführung erfolgreicher Simulationen mit den gängigen Softwarepaketen für die Simulation biologischer Systeme, z. B. GROMACS (Abraham et al., 2015), CHARMM (Brooks et al., 2009) oder NAMD (Phillips et al., 2005), zu ermöglichen. Obwohl verschiedene Möglichkeiten untersucht wurden, ist es allgemein akzeptiert, G-Atome als ungeladene Lennard-Jones-Kugeln zu beschreiben (Hummer et al., 2001; Patra et al., 2009, 2011). Eine Liste der in verschiedenen Kraftfeldern verwendeten G-Parameter wurde kürzlich veröffentlicht (Pykal et al., 2016). Ziel dieses Abschnitts ist es, die wichtigsten Ergebnisse von Berechnungsstudien zu den Wechselwirkungen zwischen G-basierten Materialien und Biomolekülen zusammenzufassen, die im Großen und Ganzen auf einer Multiskalenebene untersucht wurden. Es wurde eine Vielzahl unterschiedlicher Ansätze verwendet, wie z. B. Ganzatom- oder grobkörnige Modelle und verschiedene Parameter für Interaktionsstudien (die sogenannten Kraftfelder).

Ein allgemeines Problem in der computergestützten Biophysik ist die Kluft zwischen der Größe und der Zeitskala, die durch Simulationen untersucht werden können, und denen der biologisch relevanten Mechanismen. Die molekulare Modellierung ist in der Lage, biologische Systeme mit allen atomaren Details zu beschreiben, was jedoch ihre Anwendung auf die Untersuchung von Systemen mit einer Größe von höchstens ~150 nm und auf der Zeitskala von Mikrosekunden begrenzt. Ein möglicher Weg, diese Lücke zu schließen, ist die Verwendung von grobkörnigen Molekulardynamiksimulationen (CGMD), die auf einer kontrollierten Verringerung der Anzahl von Freiheitsgraden und der Verwendung von Wechselwirkungsfunktionen mit kürzerer Reichweite beruhen. Aufgrund dieser Vereinfachungen hat eine CG-Simulation eine geringere Auflösung, erfordert aber weniger Rechenressourcen, was die Untersuchung größerer Systeme auf längeren Zeitskalen ermöglicht. Ein vielversprechender Ansatz ist die Verwendung einer Mehrskalenbeschreibung, bei der klassische All-Atom-Simulationen mit CGMD-Simulationen abgewechselt werden.

In jüngster Zeit wurden mehrere computergestützte Studien über G-Biomolekülsysteme veröffentlicht, die sich in die folgenden Themenbereiche gliedern lassen:

1. Die Adsorption von Proteinen und Peptiden (mit besonderem Interesse an Enzymen und Blutproteinen) an G-Substraten im Zusammenhang mit der Untersuchung funktioneller Architekturen für biomedizinische Anwendungen. Die Ergebnisse zeigen, dass GO dank der sauerstoffhaltigen Gruppen, die als Reaktionsstellen für die Bindung verschiedener Moleküle dienen können, eine gute Löslichkeit in wässriger Lösung und anderen organischen Lösungsmitteln aufweist. So ist beispielsweise die Immobilisierung von Enzymen auf einem festen Substrat ein effizientes Verfahren zur Verbesserung ihrer Aktivität, während ein wichtiger Faktor für die Biokompatibilität eines Nanomaterials, das mit Blut in Berührung kommt, z. B. bei medizinischen Implantaten, die Adsorption von Proteinen an seiner Oberfläche ist.

2. Die Wechselwirkung von G mit Biomembranen, um die biologische Sicherheit oder Toxizität von G zu bewerten, sowie seine vielversprechende Funktion als Vektor für neue Antibiotika-Klassen.

3. Der Nachweis von DNA oder Proteinen durch G-Nanoporen, eine vielversprechende Klasse von Nanosensoren, die gegenüber verschiedenen Faktoren wie Temperatur und pH-Wert weniger empfindlich sind als biologische Poren.

Im nächsten Abschnitt beschreiben wir einige der Studien zu den Punkten 1 und 2 ausführlicher, während wir für die Studien zu Punkt 3 den interessierten Leser für die Untersuchung des DNA-Nachweises auf die folgenden Arbeiten verweisen (Sathe et al., 2011, 2014; Wells et al., 2012; Qiu et al., 2015; Barati Farimani et al., 2017a) und für die Untersuchung des Protein-Nachweises auf Barati Farimani et al. (2017b).

Adsorption von Biomolekülen auf Graphen

Unverfälschte Graphen-Substrate

Einer der ersten Versuche, bei dem All-Atom-MD-Simulationen zur Untersuchung der Adsorption von Proteinen auf Graphen eingesetzt wurden, ist in Zuo et al. (2011) beschrieben, wo das Villin-Kopfstück (HP35) verwendet wurde. Die Simulationen zeigten eine schnelle Adsorption von HP35 auf dem Substrat, was zu relevanten Konformationsänderungen in der sekundären und tertiären Proteinstruktur führte. Die π/π-Stapelwechselwirkungen zwischen aromatischen Resten und G dominieren die Protein-G-Wechselwirkung, anders als dies bei Simulationen von HP35 mit gekrümmten Kohlenstoffnanostrukturen beobachtet wurde.

Die Eigenschaften von G als Substrat für die Adsorption von Biomolekülen wurden in den folgenden Jahren untersucht. Katoch et al. (2012) führten MD-Simulationen in Kombination mit experimentellen Techniken wie Rasterkraftmikroskopie, Raman-Spektroskopie und Infrarot-Spektroskopie durch, um die Bindung von Peptiden an G und Graphit zu klären. In dieser Arbeit bildet ein dodekameres Peptid bei der Adsorption eine komplexe netzartige Struktur mit einer helikalen Konformation, die sich von der α-Helix unterscheidet. Cheng et al. (2013) untersuchten mittels MD-Simulationen die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Peptiden und G. In diesen Simulationen wird ein flaches G-Substrat nach der Peptidadsorption verzerrt.

Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass mehrere Faktoren, darunter Größe, Anzahl, Verteilung und Ausrichtung der Peptide, die Interaktion mit dem G-Substrat beeinflussen können. Zhou und Mitarbeiter (Gu et al., 2015) führten MD-Simulationen durch, um zu zeigen, wie Blutproteine wie bovines Fibrinogen (BFG) schnell an die G-Oberfläche adsorbieren können. Bemerkenswerterweise beschreiben diese Simulationen neben dem bereits erwähnten Effekt starker π/π-Stapelwechselwirkungen eine weitere Schlüsselwechselwirkung durch basische Reste. Diese Reste spielen während des Prozesses aufgrund der starken Dispersionswechselwirkungen zwischen ihren Seitenketten und dem Substrat eine wichtige Rolle. Insgesamt steuern hydrophobe, elektrostatische und π/π-Stapelwechselwirkungen die Immobilisierung des Moleküls auf G.

Kim et al. (2015) untersuchten die Erkennung von G durch Peptide in Bezug auf die chemische Zusammensetzung von G, die Anzahl der überlagerten Schichten und den darunter liegenden Substratträger. Die Ergebnisse dieser rechnerischen Arbeit sowie experimentelle Daten auf der Grundlage von Resonanz-Raman-Spektroskopie, Quarzkristall-Mikrowaage und Wasserkontaktwinkelmessungen deuten darauf hin, dass die Qualität von G ein wichtiger Faktor bei den Wechselwirkungen zwischen G und Peptiden ist, während die Wechselwirkung offenbar nicht wesentlich von der Anzahl der G-Schichten oder dem darunter liegenden Trägersubstrat abhängt. Cheng et al. (2013) führten MD-Simulationen zwischen verschiedenen Peptiden aus Seidenfibroin und G durch (Cheng et al., 2015). Diese Arbeit zeigt, dass G zwar mit den intramolekularen Wechselwirkungen der Proteine konkurriert und deren β-Faltblattgehalt reduziert, aber auch die Stabilität von Segmenten mit wenig geordneten Sekundärstrukturen und schwachen intramolekularen Wechselwirkungen erhöht. Insgesamt hat G bemerkenswerte Auswirkungen auf die molekulare Konformation dieser repräsentativen Sequenzen.

Darüber hinaus verwendeten Hughes und Walsh (2015) MD-Methoden mit erweiterter Abtastung, um die Zusammenhänge zwischen der Sequenz und der Bindung von adsorbierten Peptiden an G zu untersuchen. Zunächst wurde die freie Adsorptionsenergie aller 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren mit Well-Tempered Metadynamics (Barducci et al., 2008) berechnet und damit ein Maßstab für die Interpretation von Peptid-Graphen-Adsorptionsstudien geschaffen. In diesen Berechnungen wird eine starke Bindung für Aminosäuren beobachtet, die flache und/oder kompakte Seitenketten haben. Anschließend wurden Replika-Austausch mit Solute-Tempering-Simulationen (Terakawa et al., 2011) durchgeführt, um das Konformationsensemble von zwei experimentell charakterisierten Peptiden, P1 und seiner Alaninmutante P1A3, in Lösung und adsorbiert an G zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass P1A3 sowohl in Lösung als auch adsorbiert überwiegend ungeordnete Konformationen aufweist, während eine helikale P1-Konformation durch die Adsorption an G über die Wechselwirkung der stark bindenden Reste stabilisiert wird.

Im Jahr 2016 untersuchten Yeo et al. (2016) den Adsorptionsmechanismus einzelner und mehrerer Rinderserumalbumin (BSA)-Peptidsegmente an G durch die Analyse einer breiten Palette von Parametern wie root-mean-square-Verschiebung, Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen, helikaler Inhalt, Wechselwirkungsenergien und Peptid-Massezentrum-Verschiebung. Die Autoren beobachteten eine Destabilisierung der helikalen Strukturen im Einzelsegment-System, die auf starke Wechselwirkungen zwischen dem Peptid und dem Substrat zurückzuführen ist. Andererseits wird im Mehrsegment-System eine bessere Erhaltung des gesamten Helixgehalts beobachtet, was auf eine schützende kollektive Wirkung der Peptide schließen lässt. Kürzlich berichteten No et al. (2017) über eine von der Natur inspirierte zweidimensionale Peptidselbstorganisation auf G durch Optimierung der Peptid-Peptid- und Peptid-G-Wechselwirkungen. Atomistische Simulationen ermittelten die optimale Peptidsequenz, die zu einer Peptid-Selbstorganisation auf G führt, was darauf hindeutet, dass die optimale Peptidsequenz die Energie der Peptid-G-Wechselwirkung und auch die Energie der Peptid-Peptid-Wechselwirkung minimiert, was zu stabilen Komplexen auf G führt.

GO-Substrate

Die Adhäsion von Biomolekülen an GO- und rGO-Schichten wurde in Chong et al. (2015) untersucht, um die unterschiedlichen Vorteile von GO aufgrund der Anwesenheit von Sauerstoffatomen zu testen. Die Wechselwirkungen von Serumproteinen mit GO-Nanoblättern wurden mit einer Vielzahl von experimentellen Techniken und mit MD-Simulationen untersucht und zeigten hohe Adsorptionskapazitäten von GO und rGO. Es ist jedoch wichtig darauf hinzuweisen, dass in den Experimenten zwar GO und rGO verwendet wurden, jedoch unberührtes G gewählt wurde, um die relevanten nicht oxidierten Bereiche der Oberfläche von GO-Nanoblättern zu simulieren. Die Wirkung von GO wurde expliziter untersucht, indem das Substrat mit dem Lerf-Klinowski-Modell (Lerf et al., 1998) dargestellt wurde, das das Verhalten eines Standardoxidationsprozesses beschreibt.

Mit diesem Ansatz wurde in zwei paradigmatischen Artikeln (Sun et al., 2014; Zeng et al., 2016) gezeigt, dass GO eine verstärkte Adsorption des angehefteten Proteins aufweist. Erstens wurde in Sun et al. (2014) eine atomistische Beschreibung der hemmenden Wirkung von GO auf die Aktivität von α-Chymotrypsin (ChT) vorgelegt. Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass GO als vielversprechender Rezeptor für die Enzymhemmung betrachtet werden kann. Zweitens zeigen Zeng et al. (2016) die Details der Bindungsenergie von GO an Vpr13-33, ein Fragment des viralen Proteins R (Vpr), unter Verwendung von Potential of Mean Force (PMF)-Berechnungen mit der erweiterten Methode Umbrella Sampling (Kästner, 2011).

Kürzlich untersuchten Willems et al. (2017) die Dynamik von getragenen Phospholipidmembran-Patches, die auf G-Oberflächen stabilisiert sind. Diese Systeme zeigen Potenzial für die Funktionalisierung von Sensorgeräten. Die Autoren integrierten experimentelle Messungen und CGMD-Simulationen, um die molekularen Eigenschaften von unterstützten Lipidmembranen (SLMs) auf G- und GO-Trägern zu charakterisieren. Die Ergebnisse beschreiben erhebliche Unterschiede in den Topologien der stabilisierten Lipidstrukturen in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Oberfläche und liefern neue Details über die molekularen Auswirkungen von G- und G-Oxid-Oberflächen auf Lipidmembranen.

Parallel zu dieser beträchtlichen Datenmenge sind in diesem aufstrebenden Bereich der rechnergestützten Anwendungen noch viele grundlegende Fragen ungelöst, da keine ausreichenden experimentellen Ergebnisse vorliegen. Insbesondere ist die detaillierte Verteilung der sauerstoffhaltigen Gruppen auf dem Substrat schwer zu bestimmen, was einen erheblichen Verlust bei der Beschreibung des Adsorptionsmechanismus bedeutet.

Wechselwirkungen von Graphen mit Biomembranen

Die Wechselwirkung von G mit biomolekularen Komplexen ist entscheidend für das Verständnis seiner biologischen Sicherheit und potenziellen Toxizität. Eine bahnbrechende Arbeit (Tu et al., 2013) zeigte, dass GR- und GO-Nanoblätter den Abbau der inneren und äußeren Zellmembranen von Escherichia Coli induzieren. Insbesondere zeigten MD-Simulationen, dass G in der Lage ist, aktiv Phospholipidmoleküle aus einer Lipiddoppelschicht zu extrahieren und sie an seiner Oberfläche zu fixieren. Obwohl diese Ergebnisse G als praktisches Werkzeug zur Abtötung von Bakterien vorstellen, gibt es eine Fülle von Literatur, in der G auch zerstörerische Fähigkeiten gegenüber einigen Biomolekülen zeigt (Luan et al., 2015).

In diesem Zusammenhang beschreiben die Ergebnisse von CGMD-Simulationen ein ganz anderes Szenario. Eine der ersten Anwendungen von CGMD zur Untersuchung von G-Biomolekül-Wechselwirkungen findet sich in Titov et al. (2010). Dort wird das Martini-Kraftfeld (Marrink et al., 2007) verwendet, um die Wechselwirkung von G-Nanoblättern mit Phospholipid-Doppelschichten zu untersuchen, die aus 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC-Membran) bestehen. Die Ergebnisse zeigten, dass die G-Folien im hydrophoben Inneren der Membran untergebracht sind und stabile G-Lipid-Strukturen bilden (Abbildung 6).

Abbildung 6. Wechselwirkung von Graphen mit Biomembranen. (A) Gleichgewichtige Superstruktur eines Graphenblattes in der Phospholipid-Doppelschicht, die aus 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC)-Lipiden besteht. Polare Köpfe der POPC-Lipide sind als grüne Kügelchen dargestellt, hydrophobe Kohlenwasserstoffketten als dicke blaue Linien; das Graphenblatt ist mit braunen Linien dargestellt (Wassermoleküle nicht gezeigt; modifiziert mit Genehmigung von Titov et al., 2010). (B) Die Struktur von einzelnen (a) und doppelten (b) Cldn15-basierten parazellulären Poren nach den jeweiligen Äquilibrationsprotokollen. Die Protomere sind als Bänder dargestellt. Jedes cis-Dimer ist in eine hexagonale POPC-Doppelschicht eingebettet, die als Drahtstrukturen mit Phosphoratomen als Kugeln dargestellt ist. Modifiziert mit Genehmigung von Alberini et al. (2017).

 

In den darauffolgenden Jahren haben andere Arbeiten diese Systeme mit verschiedenen CGMD-Algorithmen untersucht, z. B. Guo et al. (2013), Li Y. et al. (2013) und Mao et al. (2014). In all diesen Studien wurde jedoch keine Lipidextraktion oder Membranschädigung beobachtet, im Gegensatz zu den Ergebnissen von Tu et al. (2013). In jüngerer Zeit wurden Computersimulationen verwendet, um zu klären, ob G eine Schädigung der Zellmembran verursacht (Chen J. et al., 2016). Mithilfe von MD-Simulationen mit allen Atomen wurde die Wechselwirkung von G und GO mit einer Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC)-Doppelschicht untersucht, und es zeigte sich, dass G schnell in die Membran eindringt, indem es eine Position parallel zu den Lipidschwänzen einnimmt. Umgekehrt trat GO im beobachteten Zeitraum nicht spontan in die Membran ein, sondern bildete, wenn es an die Doppelschicht angedockt war, Poren in der Membran.

Ein besonders wichtiges Biomembransystem ist dasjenige, das an der Bildung biologischer Barrieren beteiligt ist, wie z. B. die BHS. Computergestützte Studien können nützlich sein, um die Auswirkungen der Barriereexposition von G-basierten Materialien zu untersuchen (Abbildung 6), aber die Untersuchung solch komplexer Architekturen wird immer noch durch den Mangel an Strukturinformationen behindert (Alberini et al., 2017).

Fazit: Zukünftige Herausforderungen und Perspektiven

In den letzten Jahren wurden GRM in einer Vielzahl technologischer Bereiche, einschließlich biomedizinischer Anwendungen, untersucht und eingesetzt. Die Behandlung neurologischer Erkrankungen durch nicht-invasive pharmakologische Ansätze stellt nach wie vor eine große Herausforderung dar. Für die Wissenschaftler ist es von entscheidender Bedeutung, Strategien für eine effiziente Verbringung von Arzneimitteln, Biomolekülen oder sogar Genen in das Gehirn zu entwickeln, wobei die BHS umgangen und gleichzeitig ihre Struktur und ihre lebenswichtigen Funktionen erhalten werden müssen. Eines der Ziele der Nanomedizin besteht in der Tat darin, innovative Wege für die gezielte Ansprache von Zellen und die kontrollierte Freisetzung von Medikamenten zu finden, ohne dass ein chirurgischer Eingriff oder andere, für den Patienten sehr invasive Methoden erforderlich sind.

In diesem Szenario ist die Wahl des geeigneten Liganden-Rezeptor-Komplexes ein Schlüsselelement bei der Konstruktion von Nanoträgern, ebenso wie die Wahl des Materials, der Größe und der eventuellen Funktionalisierung. Während die rezeptorvermittelte Transzytose ein grundlegender Weg für die Überwindung der BHS ist, ist die Entwicklung von Nanoträgern der nächsten Generation, wie z. B. 2D-Materialien, und die Untersuchung und Optimierung alternativer Verabreichungswege, wie z. B. die intranasale Verabreichung, für die wissenschaftliche Gemeinschaft von größter Bedeutung.

Neben der “BHS-Herausforderung” könnten auch andere Aspekte der Neurowissenschaften von den neuesten Entwicklungen in der Graphenforschung profitieren. Die Neuroonkologie könnte von der Entwicklung von G-Nanoblättern und G-NP für die gezielte Bildgebung von Tumoren, die photothermische Therapie, die Verabreichung von Krebsmedikamenten und die Gentherapie profitieren. Neue elektrische, chemische und optische Sensoren könnten große Auswirkungen auf die neurologische Intensivpflege und das Neuro-Monitoring haben. Darüber hinaus kann die Kombination verschiedener Formen und Zustände von G, verschiedener chemischer Funktionalisierungen und der möglichen Verbindung mit anderen Biomaterialien zur Bildung von G-basierten Kompositen die Entwicklung eines All-in-One-Werkzeugs für Diagnose und Therapie ermöglichen, wodurch ein leistungsfähiges theranostisches Gerät entsteht.

Schließlich wird erwartet, dass die Tissue-Engineering-Forschung neuartige Gehirn-Implantat-Schnittstellen auf der Grundlage von G entwickelt, um die elektrische Leitfähigkeit des Materials zu nutzen und die Zell-Zell-Kommunikation und -Reparatur zu verbessern. Neben den experimentellen und klinischen Nachweisen entwickeln sich MD-Studien zu einem wichtigen Aspekt der Materialforschung, da sie äußerst präzise Hinweise und Vorhersagen zu G/Zell- und G/Protein-Wechselwirkungen liefern und den Forschern bei der Entwicklung leistungsfähigerer Geräte auf G-Basis helfen.

Trotz erster Studien, die die Biokompatibilität von G nachwiesen, insbesondere wenn sie mit anderen Materialien in 2D- und 3D-Gerüsten konjugiert sind, haben sich nur wenige Systeme in vivo bewährt. Es sind noch weitere Untersuchungen erforderlich, insbesondere über die biologischen Auswirkungen einer Langzeitbehandlung mit G-Materialien, bevor die versprochenen technologischen Anwendungen in den Neurowissenschaften und darüber hinaus voll genutzt werden können.

Beiträge der Autoren

MB, FC und FB konzipierten, strukturierten und schrieben die Übersichtsarbeit. Alle Autoren waren an der Abfassung der Übersichtsarbeit beteiligt, MC trug insbesondere zum Abschnitt “Einleitung” bei. EC, MLD und JFM-V trugen zum Abschnitt über neuronale Aufzeichnung und Stimulation bei. GA und LM trugen zum Abschnitt über Molekulardynamik und Modellierung bei.

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