Graphen, Graphenoxid und reduziertes Graphenoxid gelten aufgrund ihrer außergewöhnlich hohen mechanischen Steifigkeit und Festigkeit, ihrer hervorragenden elektrischen Leitfähigkeit, ihrer hohen optischen Transparenz und ihrer guten Biokompatibilität als vielversprechende Kandidaten für industrielle und biomedizinische Anwendungen.

Zusammenfassung

In diesem Artikel werden verschiedene Techniken für die Synthese von Nanomaterialien auf Graphenbasis vorgestellt und die Biokompatibilität und Toxizität solcher Nanomaterialien bei der Exposition gegenüber Säugetierzellen unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen diskutiert. Für ihre Herstellung wurden verschiedene Synthesestrategien entwickelt, die Graphen-Nanomaterialien mit unterschiedlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften hervorbringen. Entsprechend verändern sich auch ihre Wechselwirkungen mit Zellen und Organen. In der Literatur sind widersprüchliche Ergebnisse zur Biokompatibilität und Zytotoxizität von Graphen-Nanomaterialien zu finden.

Insbesondere Graphen-Nanomaterialien, die für In-vitro-Zellkulturen und In-vivo-Tiermodelle verwendet werden, können toxische chemische Rückstände enthalten, die die Graphen-Zell-Interaktionen stören und die Interpretation der experimentellen Ergebnisse erschweren. Synthesetechniken wie die Flüssigphasenexfoliation und die nasschemische Oxidation erforderten oft giftige organische Lösungsmittel, Tenside, starke Säuren und Oxidationsmittel für die Exfoliation von Graphitflocken. Diese organischen Moleküle und anorganischen Verunreinigungen, die in den endgültigen Graphenprodukten verbleiben, können mit biologischen Zellen und Geweben interagieren, was zu Toxizität und schließlich zum Zelltod führen kann. Die verbleibenden Verunreinigungen können ein höheres Risiko einer durch Graphen verursachten Toxizität in biologischen Zellen verursachen. Diese nachteilige Wirkung könnte teilweise für die Diskrepanzen zwischen verschiedenen Studien in der Literatur verantwortlich sein.

Einleitung

Die Nanotechnologie ist ein multidisziplinäres Forschungsgebiet, das mehrere unterschiedliche Disziplinen wie Biologie, Chemie, Technik, Werkstoffe, Medizin und Physik umfasst. Die Nanotechnologie befasst sich insbesondere mit der Schaffung und Entwicklung neuartiger Materialien und Geräte durch die Manipulation von Eigenschaften und Funktionen der Materie im Nanometerbereich. Auf dieser Längenskala unterscheiden sich die chemischen, mechanischen, physikalischen und biologischen Verhaltensweisen von Materialien erheblich von denen ihrer Gegenstücke aus der Masse. Die Nanotechnologie bietet ein großes Potenzial für die Entwicklung und Synthese von Nanomaterialien mit einzigartigen chemischen, biologischen, mechanischen und physikalischen Eigenschaften. Durch die Einführung der Nanotechnologie im medizinischen Bereich sind Wissenschaftler in der Lage, neue Materialien und Strategien für die genaue Erkennung und Vorbeugung von bösartigen Krankheiten, neuartige medizinische Implantate und künstliche Prothesen mit guter Biokompatibilität zu entwickeln. [1,2,3]

Materialien auf Kohlenstoffbasis wie Kohlenstoffnanoröhren und Graphen sind dafür bekannt, dass sie einen außergewöhnlich hohen Elastizitätsmodul und eine hohe mechanische Festigkeit, eine hohe Lichtdurchlässigkeit und eine ausgezeichnete elektrische Leitfähigkeit besitzen. Diese attraktiven Eigenschaften haben zu einem breiten Interesse an der Verwendung dieser Materialien für die Herstellung von elektronischen Geräten, Verbundwerkstoffen, Arzneimitteln, medizinischen Implantaten usw. geführt. So sind beispielsweise eindimensionale (1D) Kohlenstoffnanoröhren (CNT) aufgrund ihrer hohlen Struktur vielversprechende Kandidaten für die Verabreichung von Medikamenten in biologische Zellen. [4-9, 10-18]

CNTs mit einer nadelartigen Struktur können die Plasmamembran leicht durchdringen und so therapeutische Moleküle effektiv transportieren. Allerdings können zelldurchdringende Nanoröhren für biologische Zellen auch schädlich sein, da sie eine beträchtliche Toxizität und Apoptose hervorrufen. Elektronenmikroskopische Beobachtungen haben gezeigt, dass Nanoröhren im Zytoplasma vorhanden sind und dadurch oxidativen Stress auslösen, die Stoffwechselaktivität verringern und schließlich zum Zelltod führen. In dieser Hinsicht wird die Anwendung von Kohlenstoffnanoröhren im klinischen Bereich durch ihre Biodistribution, Größe und Form erschwert. [19-23]

Graphen ist eine zweidimensionale Monolage aus sp2-hybridisierten Kohlenstoffatomen, die kovalent in einem hexagonalen Gitter gebunden sind. Es ist ein Grundbaustein für Kohlenstoffmaterialien aller anderen Dimensionen, einschließlich 0D-Bucky Ball und Graphen-Quantenpunkt (GQD), 1D-Kohlenstoff-Nanoröhren und 3D-Graphit (Abbildung 1). Graphen wurde erstmals von Geim und Novoselov aus Graphit isoliert, und zwar durch mechanische Spaltung mit Hilfe eines Klebebands, um Graphenflocken zu befestigen. Mechanisch exfolierte Graphenblätter sind rein und frei von Defekten, aber ihre Ausbeute ist sehr gering. Seine Anwendung beschränkt sich auf die Forschung zur Untersuchung der elektrischen, mechanischen und optischen Eigenschaften von reinem Graphen. Daher haben die Forscher zahlreiche Studien durchgeführt, um Graphen in großem Maßstab zu synthetisieren, einschließlich seiner Derivate wie Graphenoxid (GO), reduziertes Graphenoxid (rGO) und thermisch reduziertes Graphenoxid (TRG). Die bemerkenswerten elektrischen, mechanischen und optischen Eigenschaften von Graphenblättern und GQDs machen sie zu attraktiven Materialien für den Einsatz in der Elektronik-, Optoelektronik- und Raumfahrtindustrie. [14, 24-34]

Abbildung 1: Kohlenstoffhaltige Materialien verschiedener Dimensionen. Nachdruck mit Genehmigung von Taylor & Francis.

 

Graphen und seine Derivate sowie GQDs haben sich ebenfalls schnell als vielversprechende Materialien für den Einsatz im biomedizinischen Bereich herauskristallisiert, z. B. für Biosensoren, Tissue Engineering, Bioimaging, Arzneimittelabgabe und photothermische Therapie (Abbildung 2). GQDs zeigen im Allgemeinen eine Photolumineszenz, die auf einen Quanteneinschränkungseffekt zurückzuführen ist. Daher werden GQDs im biomedizinischen Bereich für Bildgebungs- und Sensorzwecke eingesetzt. So eignen sich beispielsweise aus Pflanzenblättern gewonnene GQDs mit attraktiven photolumineszenten Eigenschaften besonders gut für das Bioimaging, einschließlich Zebrafische und menschliche Krebszelllinien. Zebrafische können in Gegenwart von GQDs (< 2 mg/mL) gesund wachsen. [2,18,38,39,40,41,42]

Das Hauptproblem bei der Verwendung von Materialien auf Graphenbasis für biomedizinische Anwendungen ist ihre Biokompatibilität. Aus den in der Literatur vorhandenen Arbeiten geht hervor, dass die Biokompatibilität von Graphen und seinen Derivaten oft widersprüchlich ist. Die Auswirkungen von Graphen-Nanomaterialien auf die Lebensfähigkeit von Zellen hängen von verschiedenen Faktoren und Versuchsbedingungen ab. Dementsprechend ist es notwendig, die Biokompatibilität und Toxizität von Graphen und seinen Derivaten durch In-vitro-Zellkulturen und In-vivo-Tiermodelle zu untersuchen. Chang et al. fanden heraus, dass GO nicht in A549-Zellen (menschliche alveoläre Basalepithelzellen) eindringt und keine offensichtliche Zytotoxizität aufweist. Allerdings neigt GO dazu, einen dosisabhängigen oxidativen Stress in den Zellen auszulösen, der bei hohen Konzentrationen eine geringe Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen bewirkt. Diese Effekte sind dosis- und größenabhängig. In ähnlicher Weise berichteten Wang et al., dass GO eine dosisabhängige Toxizität für menschliche Fibroblastenzellen und Mäuse aufweist. Ihre Ergebnisse zeigten, dass GO in Dosen von weniger als 20 μg/ml keine Toxizität für menschliche Fibroblastenzellen aufweist. Bei Dosen von mehr als 50 μg/mL wird eine offensichtliche Zytotoxizität, wie die Verringerung der Zelladhäsion und der Zellapoptose, beobachtet. [43-47]

Bei In-vivo-Tests an Mäusen zeigt GO in niedriger (0,1 mg) und mittlerer Dosis (0,25 mg) keine offensichtliche Toxizität, aber eine hohe Dosis (0,4 mg) verursacht chronische Toxizität, die zum Tod der Mäuse und zur Bildung von Lungengranulomen führt. Yang et al. untersuchten die In-vivo-Biodistribution von mit Polyethylenglykol (PEG) funktionalisiertem Graphen in Mäusen. Sie wiesen darauf hin, dass PEGyliertes Graphen bei einer Dosis von 20 mg/kg über drei Monate keine nennenswerte Toxizität hervorruft. Diese Übersicht fasst die Synthese von Graphen und seinen Derivaten sowie die Auswirkungen der Wechselwirkungen zwischen Graphen-basierten Nanomaterialien und Säugetierzellen unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen zusammen. Die Wechselwirkungen von Graphen-Nanomaterialien mit biologischen Zellen sind für die Bewertung der biologischen Sicherheit von entscheidender Bedeutung, um ihre sichere Verwendung in biomedizinischen Bereichen zu gewährleisten. [48]

Abbildung 2 Anwendungen von Graphen-Nanomaterialien in der Biomedizintechnik. Nachdruck mit Genehmigung der American Chemical Society.

 

Synthese von Nanomaterialien auf Graphenbasis

Graphen kann im Allgemeinen sowohl von oben nach unten als auch von unten nach oben synthetisiert werden. Die Top-down-Route umfasst die mikromechanische Spaltung von Graphit, die Exfoliation in der Flüssigphase und die chemische Exfoliation von Graphit zur Herstellung von GO, gefolgt von chemischen oder thermischen Behandlungen, um rGO bzw. TRG zu erhalten. Der Bottom-up-Herstellungsweg umfasst die chemische Gasphasenabscheidung und das epitaktische Wachstum auf dem SiC-Substrat (Abbildung 3). [49]

Abbildung 3 Verschiedene Methoden zur Herstellung von Graphen. Nachdruck mit Genehmigung von Springer Nature.

 

Epitaktisches Graphen auf SiC-Wafern

Graphenschichten können auf SiC-Wafern durch Oberflächensublimation von Si-Atomen aus den Wafern im Ultrahochvakuum (UHV) bei hohen Temperaturen (in der Regel über 1000 °C) erzeugt werden. Als Ergebnis bleiben überschüssige Kohlenstoffdomänen auf der Waferoberfläche zurück, die dann rekonstruiert werden, um Graphen herzustellen. Die hohen Kosten und die geringe Größe von SiC-Wafern sowie die Notwendigkeit eines UHV-Systems bei hohen Temperaturen behindern jedoch die Einführung dieses Verfahrens für die industrielle Graphenproduktion in großem Maßstab. [50,51]

Chemisch aus der Gasphase abgeschiedene Graphenschichten

Die chemische Gasphasenabscheidung (CVD) wird in der Regel zur Herstellung von großflächigen, einlagigen Graphenschichten auf Übergangsmetallen (Fe, Ni, Co, Pt, Ru usw.) eingesetzt, indem Kohlenwasserstoffgas wie Methan, Ethan oder Propan bei hohen Temperaturen in die Reaktionskammer eingeleitet wird. Cu- oder Ni-Substrate werden wegen ihrer geringen Kosten häufig verwendet und dienen als Katalysator für die Zersetzung von Kohlenwasserstoffgas (Abbildung 4). Die dünnen Schichten wurden dann auf Zielsubstrate wie SiO2/Si, Glas oder flexibles Polymer wie Poly(ethylenterephthalat) (PET) übertragen. Die Abscheidung und das Wachstum von Graphenschichten erfolgt in zwei Schritten. Der erste Schritt umfasst eine anfängliche Pyrolyse des Vorläufers zur Bildung von Kohlenstoff. Darauf folgt die Bildung einer graphitischen Struktur aus dissoziierten Kohlenstoffatomen. [52-54]

Im Allgemeinen erfolgt das CVD-Wachstum von Graphen auf einem Cu-Substrat mit geringer Kohlenstofflöslichkeit durch einen Oberflächenadsorptionsmechanismus. Dabei zersetzt sich der Kohlenstoffvorläufer und adsorbiert nur an der Metalloberfläche, gefolgt von Migration und Wachstum. Im Gegensatz dazu erfolgt Graphen auf Ni durch Entmischung und Ausfällung des Kohlenstoffs. Die Kohlenstoffspezies zersetzen sich aus dem Kohlenwasserstoffgas und diffundieren in die Nickel-Metalloberfläche mit hoher Kohlenstofflöslichkeit bei erhöhten Temperaturen, um eine feste Lösung zu bilden. Beim Abkühlen nimmt die Löslichkeit des Kohlenstoffs ab, so dass die Kohlenstoffatome aus dem Metall herausdiffundieren und sich dann auf der Nickeloberfläche ablagern und Graphen bilden. Mehrere Faktoren können das Wachstum und die Qualität von Graphenschichten beeinflussen, darunter die Art der Substratmaterialien und CVD-Verarbeitungsparameter wie Art, Konzentration, Durchflussrate und Temperatur des Ausgangsgases. [52-55]

Die Graphenfilme, die aus zufällig orientierten Grapheninseln bestehen, sind polykristallin und weisen eine hohe Dichte an Korngrenzen auf. Diese Korngrenzendefekte verschlechtern die elektrischen Eigenschaften von Graphenfilmen erheblich, da sie als Streuzentren für Elektronen dienen, was erwartungsgemäß zu einer geringeren Mobilität führt. In dieser Hinsicht ist es wünschenswert, Graphenfilme mit großen Körnern und weniger Korngrenzen oder sogar einkristalline Graphenfilme herzustellen. Vor kurzem haben Xu et al. großflächiges, einkristallines Graphen (5 × 50 cm2) auf einer ein Meter großen einkristallinen Cu(111)-Folie durch epitaktisches Wachstum von Grapheninseln auf der Kupferoberfläche hergestellt. Der so synthetisierte Graphenfilm hatte eine Mobilität von bis zu 23.000 cm2 V-1 s-1 bei 4 K. Hochwertige CVD-gewachsene Graphenfilme finden attraktive Anwendungen bei der Herstellung von biegsamen Touchpanels, Displays und optoelektronischen Geräten. [56]

Abbildung 4 Schematische Darstellung der Abscheidung von Graphen auf (a) Kupfer- und (b) Nickelsubstraten. Nachdruck mit Genehmigung der American Chemical Society.

 

Im Allgemeinen ist für praktische Anwendungen die direkte Übertragung von Graphenfilmen von Cu- oder Ni-Folien auf ein Zielsubstrat wie SiO2/Si, Glas oder PET erforderlich. Ein solcher Graphen-Übertragungsprozess kann Defekte wie Falten und Risse hervorrufen, die sich nachteilig auf die elektrischen und optischen Eigenschaften auswirken. Um den Übertragungsprozess zu vermeiden, wurde die direkte Graphen-Synthese auf nichtmetallischen Materialien wie hexagonalem Bornitrid erforscht, ohne dass eine Übertragung auf ein anderes Substrat erforderlich ist. Das direkte Graphenwachstum ist jedoch sehr langsam und die endgültige Größe des Graphenfilms ist ebenfalls begrenzt, da kein Übergangsmetall (Cu oder Ni) als Katalysator zur Verfügung steht.

Dementsprechend sind die hohen Produktionskosten und der langwierige Filmübertragungsprozess derzeit die größten Hindernisse für die Kommerzialisierung von CVD-Graphen. Da die thermische CVD hohe Temperaturen von 800-1000 °C für das Wachstum von Graphenschichten erfordert, ist es von praktischem Interesse, die Prozesstemperaturen oder -drücke zu senken, um so eine großflächige Herstellung zu geringeren Kosten zu ermöglichen. Durch geringere Drücke können unerwünschte Gasphasenreaktionen minimiert und eine gleichmäßige Schicht über das gesamte Substrat erreicht werden. Ruoff und Mitarbeiter haben gezeigt, dass einkristalline Graphenschichten durch chemische Gasphasenabscheidung bei niedrigem Druck (LPCVD) in Kupferfoliengehäusen unter Verwendung von Methan als Vorläufer synthetisiert werden können. Diese LPCVD-Filme wiesen eine hervorragende Ladungsträgerbeweglichkeit auf. [28,57,58]

Exfoliation in flüssiger Phase

Die Flüssigphasenexfoliation (LPE) ist aufgrund ihrer geringen Kosten und Einfachheit ein skalierbarer Weg für die Massenproduktion von Graphen. Bei diesem Verfahren wird Graphit in einem Lösungsmittel dispergiert, um die van-der-Waals-Kräfte zwischen den Graphen-Zwischenschichten in Gegenwart oder Abwesenheit von Tensiden zu schwächen. Die Exfoliation des Graphits in Graphenblätter kann durch Ultraschall oder Scherung erfolgen. Danach folgt ein Reinigungsschritt, um ein- und mehrlagige Graphenblätter zu erhalten. Diese Strategie ermöglicht die Synthese von geschichteten Graphenblättern in Form einer Lösemittelsuspension. Da Tenside, organische Lösungsmittel und starke Säuren verwendet werden, um die Graphenflocken in dem spezifischen Medium zu exfolieren und zu stabilisieren, können sie Probleme mit der Umweltverschmutzung verursachen. Außerdem lassen sich Rückstände von Tensiden nur schwer von Graphenblättern entfernen. Die meisten der verwendeten organischen Lösungsmittel (z. B. N,N-Dimethylformamid (DMF), N-Methyl-2-Pyrrolidon (NMP), Dichlorbenzol (DCB)) sind hochgiftig, können Zelltoxizität verursachen und sollten für Zellmanipulationszwecke vermieden werden. [30]

Chemische und thermische Reduktion von GO

Graphenoxid ist ein Graphenderivat, das durch chemische Oxidation von Graphitflocken in starken Oxidationsmitteln hergestellt wird. Zur Herstellung von GO wird häufig das modifizierte Hummers-Verfahren angewandt, bei dem Graphitflocken mit einer Mischung aus Schwefelsäure, Natriumnitrat und Kaliumpermanganat unter kräftigem Rühren oder Beschallen zur Reaktion gebracht werden. Die Suspension wird mit Wasser verdünnt, dann wird Wasserstoffperoxid hinzugefügt, um einen höheren Oxidationsgrad zu erreichen, und anschließend mit Wasser gespült. Die Nachteile dieses Verfahrens sind die langen Verarbeitungszeiten und die Entstehung von giftigen Gasen (NO2 und N2O4). Um diese Probleme zu lösen, modifizierten Tour und Mitarbeiter diese Methode, indem sie Natriumnitrat durch Phosphorsäure in einem Mischverhältnis H2SO4/H3PO4 (9:1) ersetzten und gleichzeitig die KMnO4-Konzentration erhöhten. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass keine giftigen Gase entstehen. Zu den Nachteilen gehören der Verbrauch einer großen Menge KMnO4 sowie mühsame Sieb-, Filtrier-, Zentrifugier- und Waschvorgänge. Daher wurden verschiedene Methoden entwickelt, um das Hummers-Verfahren weiter zu modifizieren, z. B. die Verwendung von Kaliumferrat (K2FeO4) als starkes Oxidationsmittel anstelle von KMnO4 und der Verzicht auf NaNO3 bei der GO-Herstellung. [59,60,61]

GO ist im Allgemeinen mit funktionellen Sauerstoffgruppen wie Carboxyl, Hydroxyl und Epoxid dekoriert. GO-Folien sind daher amphipathisch und haben sowohl hydrophile als auch hydrophobe Komponenten. Durch das Vorhandensein von Carboxylgruppen an den Rändern werden sie bei Kontakt mit Wasser leicht hydratisiert. Dank der funktionellen Sauerstoffgruppen kann GO auch in verschiedenen organischen Lösungsmitteln wie Aceton, DCB, NMP und DMF dispergiert werden. Zusätzlich zu den oben genannten Problemen leidet das Hummer-Verfahren immer noch unter bestimmten Mängeln, einschließlich Umweltproblemen im Zusammenhang mit der Verwendung von starken Oxidationsmitteln und dem Eintrag von Verunreinigungen in die GO-Produkte. Darüber hinaus kann eine große Menge an Abfallsäuren und Oxidationsmitteln bei der großtechnischen Herstellung von GOs in der Industrie zu Umweltverschmutzung führen. [32,34,62,63]

Was die Gesundheit betrifft, so kann eine Spur von Mn in GOs, die aus Kaliumpermanganat gewonnen werden, deren physikalische Eigenschaften verschlechtern und in Säugetierzellen Toxizität hervorrufen. In dieser Hinsicht hat die grüne Synthese von GOs in den letzten Jahren große Aufmerksamkeit auf sich gezogen, insbesondere im biomedizinischen Bereich. GO ist ein elektrischer Isolator, und seine Leitfähigkeit kann durch chemische Reduktion mit Reduktionsmitteln wie Hydrazin und Natriumborhydrid teilweise wiederhergestellt werden, um rGO zu erhalten. Bislang ist Hydrazin aufgrund seiner starken Reduktionsaktivität zur Entfernung sauerstoffhaltiger Gruppen noch immer das am häufigsten verwendete Mittel. Bei der chemischen Reduktion von GO zu rGO können sauerstoffhaltige Gruppen jedoch nicht vollständig entfernt werden. Dementsprechend enthält rGO immer noch eine gewisse Menge an Restsauerstoffgruppen. Alternativ kann durch schnelles Erhitzen von GO auf 1050 °C unter Vakuum oder in einer inerten Atmosphäre TRG erzeugt werden, so dass sauerstoffhaltige funktionelle Gruppen als Kohlendioxid entfernt werden. [64-67]

Graphen-Polymer-Nanokompositen

Reines Graphen weist einen außergewöhnlich hohen Elastizitätsmodul von etwa 1 TPa und eine Eigenfestigkeit von 130 GPa, eine hervorragende optische Transparenz von 97,7 % sowie eine ausgezeichnete elektrische Leitfähigkeit und Mobilität von 2 × 105 cm2 V-1 s-1 auf. In dieser Hinsicht ist Graphen ein attraktives Füllmaterial für Polymere, um funktionelle Polymer-Nanokomposite zu bilden. Die Leistung von Polymeren mit hoher Flexibilität kann durch Zugabe von Füllstoffen in Mikro- oder Nanogröße auf bestimmte Anwendungen zugeschnitten werden. Polymerverbundwerkstoffe erben die vorteilhaften Eigenschaften ihrer Bestandteile, und darüber hinaus bieten die Polymere eine schützende Matrix für die eingebetteten Füllstoffe, die sie vor mechanischer Beschädigung schützen. Herkömmliche Polymer-Mikroverbundwerkstoffe werden aufgrund ihres geringen Gewichts, ihrer einfachen Herstellung und ihrer niedrigen Kosten häufig als Strukturbauteile in der Biomedizin und in der Industrie eingesetzt. Um die gewünschten biologischen, mechanischen und physikalischen Eigenschaften zu erreichen, sind jedoch hohe Füllstoffgehalte (≥30 %) erforderlich. Große Füllstoffvolumina wirken sich nachteilig auf die Eigenschaften von Polymer-Mikrokompositen aus. In dieser Hinsicht können Nanomaterialien auf Graphenbasis mit geringen Füllstoffgehalten zum Füllen und Verstärken von Polymeren verwendet werden. [8,9,68-70,71-76]

Wie bereits erwähnt, wird unbehandeltes CVD-Graphen hauptsächlich für optoelektronische Geräte, Touchscreens und die Photovoltaik entwickelt. LPE-Graphenflocken enthalten Rückstände von Lösungsmitteln und Tensiden, die sich negativ auf die Gesundheit auswirken. In dieser Hinsicht werden GO mit sauerstoffhaltigen Gruppen als ideale Füllstoffe zur Verstärkung von Polymeren angesehen. Diese funktionellen Gruppen machen GO hydrophil, so dass sie mit wasserlöslichen Polymeren, wie z. B. Polyvinylalkohol, reagieren können. In der Literatur wird der Elastizitätsmodul von GO-Monolagen mit 207,6 ± 23,4 GPa angegeben, was einem Viertel des Moduls von reinem Graphen entspricht. Dennoch ist der Modul von GO immer noch viel höher als der von Biopolymeren, wie Polymilchsäure (PLA) mit einem Modul von etwa 2,7-3 GPa und Polycaprolacton (PCL) von 0,4 GPa. GO kann also zur Verstärkung von GO/PLA- und GO/PCL-Nanokompositen mit verbesserter mechanischer Leistung, thermischer Stabilität und Biokompatibilität verwendet werden. Diese Polymer-Biokomposite können auf verschiedene Weise hergestellt werden, z. B. durch Mischen von Lösungen, Mischen in der Schmelze und Elektrospinnen. [77-81]

Lebensfähigkeit und Toxizität von Zellen

Nanomaterialien auf Graphenbasis können für biologische Zellen entweder biokompatibel oder toxisch sein. Die Reaktion lebender Zellen auf diese Nanomaterialien hängt stark von der Anzahl der Schichten, der lateralen Größe, der Reinheit, der Dosis, der Oberflächenchemie und der Hydrophilie ab. Die Oberflächenchemie von Graphen-Nanomaterialien variiert stark aufgrund unterschiedlicher Strategien für ihre Synthese und der Verfügbarkeit verschiedener Moleküle oder Polymere für die Oberflächenfunktionalisierung. Im Allgemeinen werden für die In-vitro-Bewertung der Toxizität von Nanomaterialien mehrere wichtige Zelllinien verwendet, darunter Phagozyten (z. B. Makrophagen) und nichtphagozytäre Zellen (z. B. Endothel- und Epithelzellen, Krebszellen, Erythrozyten usw.). Ein genaues Verständnis der Wechselwirkungen von Graphen-Nanomaterialien mit diesen Zellen ist von entscheidender Bedeutung für ihre Verwendung in medizinischen Anwendungen.

Die Wechselwirkungen von Graphen-Nanomaterialien mit Zellmembranen können auch zu Membranschäden und Zytotoxizität führen. Die Phospholipide der Zellmembranen bestehen aus einer Phosphatkopfgruppe und zwei Fettsäureketten. Zu den primären Kopfgruppen gehören Cholin, Serin, Glycerin, Ethanolamin, Inositol und Phosphatsäure. Die verschiedenen Kopfgruppen der Phospholipide verleihen ihnen unterschiedliche Eigenschaften. Darüber hinaus enthalten Zellmembranen auch Cholesterinmoleküle, die eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der Membranstruktur, der Aufrechterhaltung der Fluidität und der Modulation der Aktivitäten von membranassoziierten Proteinen spielen. Reines Graphen ohne Ladungen auf der Basalebene kann nicht elektrostatisch mit Phospholipiden wechselwirken, sondern begünstigt hydrophobe Wechselwirkungen mit den Lipidschwänzen. Außerdem können hydrophobe Wechselwirkungen zwischen reinem Graphen und Cholesterinschwänzen Cholesterinmoleküle aus der Membran extrahieren oder entfernen, was zu einer Schädigung der Membran führt.

So wiesen Bernabo et al. darauf hin, dass GO mit der Zellmembran von Schweinespermien interagieren kann, was zu einer Extraktion von Cholesterin aus der Membran führt. Aus der theoretischen Simulation von Biomembransystemen geht hervor, dass die Extraktion von Cholesterinmolekülen aufgrund der starken Kräfte, die von der Graphenschicht ausgehen, zur Bildung von Hohlräumen und zur Verformung der Membran führt, was einen Verlust der Membranintegrität zur Folge hat. Kürzlich berichteten Duan et al., dass GO Phospholipide aus den Zellmembranen menschlicher Alveolarepithelzellen (A549) und Mausmakrophagen (Raw264.7) extrahieren kann, wodurch Oberflächenporen entstehen, wie aus den REM-Aufnahmen hervorgeht. Dieser Effekt reduzierte die Lebensfähigkeit der Zellen und führte schließlich zum Zelltod. Auf der Grundlage von Molekulardynamiksimulationen (MD) führten sie dies auf die starken Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Domänen von GOs und Lipidschwanzkohlenstoffen zurück. [82-84]

Die Oberflächenladung und die Oberflächenchemie von GO haben erhebliche Auswirkungen auf die zellulären Interaktionen. GO weist eine hohe negative Ladungsdichte auf, die von sauerstoffhaltigen funktionellen Gruppen herrührt, so dass es zu elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen GO und den Lipiden der Membran kommen kann. In diesem Zusammenhang bereiteten Li et al. fünf Lipide mit der gleichen 18-Kohlenstoff-Alkylkette, aber unterschiedlichen Kopfgruppenladungen vor und untersuchten die Wechselwirkungen zwischen GO und Lipiden mit Hilfe der Langmuir-Monolayer-Technik. Sie fanden heraus, dass GO mit positiv geladenen Lipidkopfgruppen durch elektrostatische Wechselwirkungen interagieren kann, nicht aber mit neutral oder negativ geladenen Lipiden. Bekanntlich sind die elektrischen Ladungen der Phospholipide von Säugetierzellmembranen negativ oder neutral. Es ist unwahrscheinlich, dass negativ geladene Lipide GO mit den gleichen Ladungen anziehen. Hu et al. wiesen darauf hin, dass negativ geladene GO von Lipiden gleicher Ladung elektrostatisch abgestoßen werden, während hydrophobe Wechselwirkungen zwischen negativ geladenen GO und Lipiden die Adsorption von GO an den Lipiden erleichtern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass GOs durch hydrophobe Wechselwirkungen direkt Schäden an der Zellmembran verursachen können, ohne in die Zellen einzudringen. Erst kürzlich untersuchten Xia und Mitarbeiter die Auswirkungen der GO-Oberflächenchemie auf die Lipidmembraninteraktionen unter Verwendung von unbehandeltem GO, hydratisiertem GO (hGO) und rGO. [85-87]

Sie berichteten, dass hGO die Lipidperoxidation der Oberflächenmembran auslösen kann, was zur Membranlyse und zur Zerstörung der Zellintegrität führt. hGO wurde durch Reaktion von GO mit Natriumhydroxidlösung bei 50 oder 100 °C synthetisiert. Während des Hydratationsprozesses reagierten die Epoxidringe von GO mit Nukleophilen in der Lösung und bildeten C-OH-Gruppen und Kohlenstoffradikale (*C), die mit Hilfe der paramagnetischen Elektronenresonanztechnik nachgewiesen wurden. Diese Radikale waren aufgrund des Vorhandenseins ungepaarter Elektronen reaktiv und reagierten leicht mit Sauerstoff zu Superoxidradikalen, die in der Lage waren, ungesättigte Lipide und Thiolgruppen auf Proteinen zu oxidieren und Lipoperoxide zu bilden. Dies führte zu einer Störung der Membranintegrität und zum Zelltod in menschlichen leukämischen Monozyten THP-1 und menschlichen Bronchialepithelzellen BEAS-2B. Die Epoxidgruppe von reinem GO konnte ebenfalls Kohlenstoffradikale bilden, jedoch in geringerem Maße als hGO. Die Zytotoxizität, die von den GO-basierten Materialien in beiden Zelltypen ausgelöst wird, ist also in der Reihenfolge hGO > GO > rGO.

Abgesehen von den Wechselwirkungen zwischen Lipidmembran und Nanomaterialien können Nanomaterialien auf Graphenbasis aufgrund ihrer geringen Größe und scharfen Kanten auch in das Zytoplasma eindringen. Sie können die Zellmembran leicht durchdringen, was zu einer Beschädigung der Membran und zum Austritt von Zytoplasma-Inhalten führt. Wenn sie sich in lebenden Zellen befinden, können sie durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die durch die Verringerung des mitochondrialen Membranpotenzials (MMP) eine mitochondriale Störung und durch die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) eine Schädigung der Zellmembran verursachen können, Toxizität verursachen. Im letzteren Fall können ROS eine Lipidperoxidation auslösen, indem sie mit ungesättigten Fettsäuren der Membranlipide reagieren und Lipidperoxide wie Malondialdehyd (MDA) bilden. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass GO die extrazelluläre und intrazelluläre ROS-Bildung selbst bei niedrigen Dosen dosis- und zeitabhängig induzieren kann.

Daher sind die ROS-Produktion, die mitochondriale Dysfunktion und der LDH-Austritt die Schlüsselfaktoren für den Zelltod, wie im Fall der menschlichen HaCaT-Keratinozyten. Wenn die Nanomaterialien in den Zellkern eindringen können, könnten sie direkt mit der DNA interagieren und Genotoxizität verursachen. Darüber hinaus können In-vitro- und In-vivo-Bedingungen wie die Graphen-Dosis, die Dauer der Exposition, der Zell- oder Tiertyp und die zur Bewertung der Zelllebensfähigkeit verwendete Technik die Biokompatibilität und toxische Wirkung von Graphen-Nanomaterialien beeinflussen. Daher ist ein angemessenes Verständnis der Wechselwirkungen von Nanomaterialien auf Graphenbasis mit biologischen Systemen und ihrer nachteiligen Auswirkungen für die weitere Entwicklung und sichere Verwendung dieser Nanomaterialien erforderlich. [88]

In-vitro-Zellkultivierung

CVD-gewachsenes Graphen

Die Verwendung von reinem Graphen ermöglicht uns ein besseres Verständnis der direkten Reaktion und Interaktion zwischen nanostrukturiertem Graphen und biologischen Zellen. In der Literatur wurden widersprüchliche Ergebnisse in Bezug auf die Auswirkungen von reinen Graphenfilmen auf die Biokompatibilität und Zytotoxizität von Zellsystemen berichtet. Zhang et al. setzten CVD-gewachsenes Graphen mit Dosen von 0,01, 0,1, 1, 10 und 100 µg/mL neuronalen PC12-Zellen für 1, 4 und 24 Stunden aus. Bei der niedrigsten Dosis von 0,01 µg/mL hatte Graphen keine Auswirkungen auf die metabolische Aktivität, die LDH-Freisetzung und ROS. Bei einer hohen Dosis von 10 µg/mL induzierte Graphen zytotoxische Wirkungen, indem es die mitochondriale Aktivität auf der Grundlage der Ergebnisse des 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Tests verringerte und gleichzeitig die ROS-, Caspase-3- und LDH-Werte erhöhte. Beim Caspase-3-Test (Apoptosemarker) trat Apoptose bei Graphen-Dosen ≥10 µg/mL auf. [89-95]

Somit waren die zytotoxischen Wirkungen von Graphen dosis- und zeitabhängig. Es ist allgemein bekannt, dass ROS zelluläre Lipid-, Protein- und DNA-Moleküle oxidieren können und dadurch die zelluläre Signalübertragung und den Stoffwechsel beeinflussen. Eine erhöhte ROS-Produktion kann zu einer Depolarisierung der mitochondrialen Membran führen und die Aktivierung von Caspasen fördern. Die Depolarisierung der Mitochondrienmembran resultiert aus einem Verlust an mitochondrialer Membranintegrität, was zu einem Rückgang der MMP führt. Dies wiederum verzögert die ATP-Synthese in den Mitochondrien, die das Kraftwerk der Zelle sind. Caspasen sind interzelluläre Proteasen, die für die proteolytische Spaltung verantwortlich sind. Caspase-3 ist die wichtigste Caspase, die an der Durchführung der Apoptose beteiligt ist.

Im Gegensatz dazu fanden Nayak et al. heraus, dass CVD-gewachsene Graphenfilme die Proliferation menschlicher mesenchymaler Stammzellen (hMSCs) nicht behindern, sondern ihre spezifische Differenzierung in Knochenzellen beschleunigen. Sie untersuchten die Wirkung von Graphen auf die Proliferation von hMSCs unter Verwendung von vier Substratmaterialien mit unterschiedlicher Steifigkeit und Oberflächenrauhigkeit, darunter Polydimethylsiloxan (PDMS), PET, Glasobjektträger und SiO2/Si. Alle mit Graphen beschichteten Substratproben zeigen eine starke Zunahme der Kalziumablagerungen aufgrund der Knochenbildung. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse des MTT-Tests und die Immunfluoreszenzbilder eine gute Lebensfähigkeit und Morphologie der Zellen. [90]

Kim et al. wiesen auch nach, dass CVD-gewachsene Graphenfilme eine stabile Zellanhaftung und ausgezeichnete Biokompatibilität mit primären erwachsenen Herzzellen (Kardiomyozyten) aufweisen. Graphenfilme mit hoher elektrischer Leitfähigkeit eignen sich besonders für die Anhaftung von Nervenzellen, da die Funktionen von Nervenzellen mit elektrischen Aktivitäten verbunden sind. In diesem Zusammenhang berichteten Park et al. über eine verbesserte Differenzierung menschlicher neuraler Stammzellen in Neuronen auf einem mit Graphen beschichteten Glassubstrat. [91,92]

Die Zellmigration und -adhäsion wird durch große Proteinkomplexe koordiniert, die allgemein als fokale Adhäsionen (FAs) bekannt sind. FAs enthalten hohe Konzentrationen von Vinculin, Talin, Paxillin, α-Actinin, fokaler Adhäsionskinase usw. Insbesondere das Protein Vinculin kontrolliert die Zelladhäsion. Es verbindet die Aktinfilamente über Talin und das Transmembranprotein Integrine mit der extrazellulären Matrix (ECM). Integrine spielen eine Schlüsselrolle bei der Weiterleitung von Signalen von der Zellmembran ins Innere der Zelle. Es wird davon ausgegangen, dass die nanoskalige Topographie künstlicher Substrate die FAs und die damit verbundene Zelladhäsion, Proliferation und Differenzierung regulieren kann. Erst kürzlich untersuchten Lasocka et al. die Adhäsion und Proliferation von L929-Mausfibroblasten auf CVD-gewachsenen Graphenfilmen. Sie wiesen darauf hin, dass Graphenfilme keine Zytotoxizität für L929-Fibroblasten aufweisen. Darüber hinaus erhöht der nanostrukturierte Graphenfilm die Zelladhäsion nach 24 Stunden Kultivierung (Abbildung 5). Auf Immunfluoreszenzbildern sind Vinculin- und Aktinstressfasern auf Fibroblasten zu sehen, die sowohl auf Graphenfolie als auch auf Glassubstrat wachsen. [93-95]

Die Zellen auf der Graphenfolie weisen eine stärkere Expression von Vinculin auf, was die Anzahl der fokalen Adhäsionen betrifft. Vor allem Aktin-Stressfasern sind in Fibroblasten, die auf Graphen wachsen, deutlicher zu erkennen. Stressfasern bestehen im Allgemeinen aus Bündeln von F-Actin-Filamenten (Zytoskelettprotein), die durch α-Actinin miteinander vernetzt sind. Es scheint, dass nanostrukturiertes Graphen die Expression von FAs fördert, indem es die Vinculin-Expression reguliert und so die Zelladhäsion verbessert. Lasocka et al. verwendeten auch den kolorimetrischen CCK-8-Test zur Bewertung der lebensfähigen Zellen und der Zellproliferation und stellten fest, dass die mitochondriale Aktivität von L929 um etwa 12 % höher war als die auf einer Kontrollglasprobe (Abbildung 6). CCK-8 enthält ein Tetrazoliumsalz, WST-8, bestehend aus [2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-Tetrazolium, Mononatriumsalz], das durch zelluläre Dehydrogenasen zu wasserlöslichem Formazan reduziert wird. Die Menge des gebildeten Formazans ist direkt proportional zur Anzahl der lebenden Zellen. Die Nachweisempfindlichkeit von CCK-8 ist höher als die anderer Tetrazoliumsalze, wie MTT und WST-1.

Abbildung 5 Immunolabeling von L929-Zellen, die 24 Stunden lang auf der Glas- (Kontrolle) und der unberührten Graphen-Monolage gewachsen sind: Phalloidin-FITC für das Aktin-Zytoskelett (grün), Anti-Vinculin-Antikörper für Vinculin (rot) und Hoechst 33342-Färbung für DNA (blau). Weiße Pfeile zeigen Aktin-Stressfasern (linkes Feld) und fokales Adhäsionsprotein-Vinculin (mittleres Feld) an. Wiedergegeben aus [95] mit Genehmigung von Elsevier.
Abbildung 6 Mitochondriale Aktivität (CCK-8-Assay) von L929-Fibroblasten, die auf Glas- und Graphen-Substraten gewachsen sind. Die Daten sind als Mittelwert ± SD (Standardabweichung) von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. ** p < 0.01. Nachdruck aus [95] mit Genehmigung von Elsevier.

Kürzlich untersuchten Rastogi et al. die Wirkung von LPCVD-gewachsenen Graphenschichten auf die Lebensfähigkeit und den Zellstress von nichtneuronalen (Affen-Nierenfibroblasten; Cos-7) und neuronalen (Hippocampus-Neuronen der Ratte) Zellen. Sie berichteten, dass Graphen die Zelladhäsion und das Wachstum der beiden Zelllinien verbessert. Darüber hinaus hat Graphen keine nachteiligen Auswirkungen auf die MMP und die Morphologie beider Zelltypen, was beweist, dass reines Graphen keinen Zellstress auslöst. In der Studie wurden der Live-Dead-Assay und der Tetramethylrhodaminethylester (TMRE)-Assay verwendet. TMRE ist ein quantitativer Fluoreszenzmarker für die mitochondriale Aktivität. [96]

Der Live-Dead-Assay ist ein Fluoreszenztest für die Lebensfähigkeit von Zellen, mit dem lebende und tote Zellen anhand der Membranintegrität und der zytotoxischen Folgen beurteilt werden können. Die Membranen lebensfähiger Zellen sind intakt und dicht, während die Membranen toter Zellen gestört oder beschädigt sind. Bei dem Test werden die Farbstoffe Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM) und Ethidium-Homodimer zum Anfärben lebender bzw. toter Zellen verwendet. Calcein-AM färbt lebende Zellen grün, während EthD-III tote Zellen rot färbt. Calcein-AM ist eine nicht fluoreszierende Verbindung und wird durch die Hydrolysereaktion intrazellulärer Esterasen in lebenden Zellen in grün fluoreszierendes Calcein umgewandelt. Abbildung 7 zeigt die Ergebnisse des Lebend-Tot-Assays für Cos-7-Zellen, die für verschiedene Zeiträume auf unbehandeltem Graphen und Glas (Kontrolle) kultiviert wurden. Offensichtlich zeigen die Graphenfilme keine nachweisbaren zytotoxischen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Die Folien fördern die Zelladhäsion und das Zellwachstum, insbesondere nach 96 Stunden (Abbildung 7C (II)).

Abbildung 7 Lebend-Tot-Assay für Cos-7-Zellen, die auf (I) Glas und (II) Graphen für (A) 24 h, (B) 48 h und (C) 96 h kultiviert wurden. Grün, rot und blau kennzeichnen jeweils lebende Zellen, tote Zellen und Zellkerne. Skalenbalken: 100 μm. (D) Zellzahl und (E) prozentuale Lebensfähigkeit von Cos-7-Zellen, die 24, 48 und 96 Stunden lang auf Glas (orange) bzw. Graphen (grün) kultiviert wurden. * und ** bezeichnen p < 0,05 bzw. p < 0,005. NS bedeutet, dass es keinen statistisch signifikanten Unterschied gibt. Wiedergegeben aus [96] mit Genehmigung der American Chemical Society.

In den letzten Jahren wurden Titan und seine Legierungen zunehmend für die Herstellung von Zahnimplantaten verwendet. Legierungen auf Ti-Basis weisen im Allgemeinen eine viel höhere Korrosionsbeständigkeit auf als rostfreie Legierungen. Allerdings leiden Metalle auf Ti-Basis während ihrer Lebensdauer in der Mundhöhle unter einem hohen Verschleißverlust. Die Oberflächenmodifizierung von Zahnimplantaten mit harten Beschichtungen ist bekanntlich sehr wirksam, um Abnutzungserscheinungen und die Ansammlung von bakteriellem Zahnbelag auf den Implantaten zu bekämpfen. In dieser Hinsicht ist eine inerte Graphenschicht mit hoher Härte ein attraktives Material für die Beschichtung von Zahnimplantaten.

So kann ein as-synthetisierter CVD-Graphenfilm auf ein Ti-Metallsubstrat übertragen werden, um dessen Verschleißfestigkeit und bakterizide Eigenschaften zu verbessern. Zhou und Mitarbeiter untersuchten die Adhäsion, Proliferation und osteogene Differenzierung menschlicher Fettstammzellen (hASCs) und menschlicher mesenchymaler Stammzellen (hMSCs) in vitro und in vivo, wenn sie CVD-Graphen beschichteten Ti-Scheiben ausgesetzt waren. Für den In-vivo-Test wurden CVD-Graphen/Ti-Scheiben in den subkutanen Rückenbereich von Nacktmäusen implantiert. Ihre Ergebnisse zeigten, dass reines Graphen die osteogene Differenzierung von hASCs und hMSCs in vitro und in vivo fördert. [97-100]

Graphene Oxide und ihre Derivate

Graphene Oxide

Aufgrund der einfachen Herstellung und der relativ geringen Kosten wurden umfangreiche Studien zur Biokompatibilität/Zytotoxizität von GOs durchgeführt. GO kann je nach Größe, Dosierung, Zeit, Zelltyp und Oberflächenchemie die Lebensfähigkeit von Zellen verbessern oder zum Zelltod führen. Aufgrund der unterschiedlichen Oberflächenoxidationsstufen und -merkmale von GO, rGO und TRG weisen diese Graphenmaterialien unterschiedliche chemische und physikalische Eigenschaften auf. GO weist viele Defekte auf, z. B. Leerstellen aufgrund der Synthese, wie hochauflösende TEM-Bilder und Raman-Spektren zeigen. TRG, das durch schnelles Erhitzen von GO bei hohen Temperaturen hergestellt wird, weist eine faltige Struktur auf. [31,32,67]

Das modifizierte Hummers-Verfahren wird von den Forschern häufig zur Oxidation von Graphit verwendet. Es wurden jedoch verschiedene Oxidationszeiten und -temperaturen sowie unterschiedliche Arten und Konzentrationen von Oxidationsmitteln für die Synthese von GOs verwendet. Folglich enthalten die resultierenden GOs unterschiedliche O-Gehalte oder O/C-Verhältnisse. Die O/C-Verhältnisse in GOs haben einen großen Einfluss auf ihre strukturellen Eigenschaften, die sich im Grad der Exfoliation, der Anzahl der Graphenschichten, der Dicke und der lateralen Schichtgröße, dem Defektanteil, der Konzentration funktioneller Gruppen usw. zeigen. Infolgedessen würden GOs mit unterschiedlichem Oxidationsgrad und Verunreinigungen bei Exposition gegenüber derselben Zelllinie unterschiedlich interagieren. Die strukturelle Vielfalt von GOs führt in der Literatur zu widersprüchlichen Ergebnissen in Bezug auf Biokompatibilität und Toxizität. Daher scheint es notwendig zu sein, den Syntheseprozess bei der Verwendung von GOs für biomedizinische Anwendungen zu standardisieren. [59,60,61]

Bei der Synthese von GO werden in der Regel mehrere starke Oxidationsmittel verwendet, die Restverunreinigungen oder Verschmutzungen in die Endprodukte einbringen können. Wong et al. bestimmten die Arten und den Gehalt an Verunreinigungen sowohl in GO als auch in rGO. Sie berichteten, dass chemische Oxidations- und Reduktionsschritte während der Herstellung verschiedene metallische Elemente in GO und rGO einbringen können. Die wichtigsten Verunreinigungen waren Mangan (etwa 2.290 ppm), Kalium (820 ppm), Natrium (96 ppm) und Fe (82 ppm). Diese Verunreinigungen stammten aus Schwefelsäure-, Natriumnitrat- und Kaliumpermanganat-Reagenzien. Andere nachweisbare Metallverunreinigungen waren Ca, Co, Cr, Cu, Ni, Pb und Zn. Außerdem führten die Reduktionsmittel Hydrazin und Natriumborhydrid (NaBH4) zu höheren Fe- und Na-Konzentrationen im rGO. Der Fe- und Na-Gehalt stieg durch die Reduktion mit NaBH4 von 82 auf 123 bzw. 7600 ppm. Verbleibende Mn- und Fe-Verunreinigungen in GOs beeinträchtigten ihre physikalischen Eigenschaften erheblich. [101]

Schwermetalle wie Mn, Fe und Cr sind besonders schädlich oder giftig für Säugetierzellen. Mangan kann Toxizität in Lungen- und Nervenzellen hervorrufen und mitochondriale Störungen verursachen, indem es die MMP verringert und die Ca2+-Aktivierung durch Kontrolle der ATP-Syntheserate während der oxidativen Phosphorylierung hemmt. So kann das Vorhandensein von Mn im Zellkern von PC12-Zellen zu Chromatinkondensation, DNA-Fragmentierung und erhöhten mRNA-Werten von Caspase-3 führen. Mn kann auch die Blut-Hirn-Schranke überwinden und in das Gehirn gelangen. Bei Exposition gegenüber Mangan im menschlichen Körper treten toxische Wirkungen vor allem in den Atemwegen und im Gehirngewebe auf, einschließlich Lungenembolie, Bronchitis und Nervenschäden. [93, 102,103]

Es wurde berichtet, dass einwandige Kohlenstoffnanoröhren mit Spuren von Co, Cr, Fe, Ca und Si toxischer sind als verunreinigungsfreies GO (elektrochemisch synthetisiert), das in denselben Zelllinien exponiert wurde. Es ist erwähnenswert, dass chemische Substanzen wie wasserfreies Hydrazin, Hydrazinmonohydrat und Natriumborhydrid, die üblicherweise für die Reduktion von GO verwendet werden, für den Menschen sehr giftig sind. Diese Chemikalien müssen bei der Herstellung von rGO für die Zellmanipulation vermieden werden. Stattdessen können umweltfreundliche Naturprodukte wie Glukose, Teepolyphenol und Ascobinsäure als Reduktionsmittel verwendet werden. In den letzten Jahren wurden Anstrengungen unternommen, rGO mit umweltfreundlichen Extrakten aus natürlichen Pflanzen wie Pilzen, Palmenblättern und Aloe Vera zu synthetisieren. So reduzierten Dasgupta et al. erfolgreich GO in wässriger Lösung mit Polysacchariden, die sie aus einem wild wachsenden Speisepilz extrahierten. Sie berichteten, dass rGO bei Konzentrationen unter 100 μg/mL biologisch sicher ist. [65,104,105,106]

Chang et al. untersuchten die Auswirkungen von Größe und Dosis auf die Biokompatibilität von GO, die A549-Zellen ausgesetzt wurden. In ihrer Arbeit wurden GOs mit Größen von 780 ± 410 nm (l-GO), 430 ± 300 nm (m-GO) und 160 ± 90 nm (s-GO) verwendet. GO zeigten eine gute Biokompatibilität mit A549-Zellen und wiesen keine Anzeichen von Zytotoxizität auf (Abbildung 8). Der CCK-8-Test zeigte, dass die Wirkung von l-GO und m-GO auf die Lebensfähigkeit von A549-Zellen gering war. Die Zellen behielten ein hohes Maß an Lebensfähigkeit (über 80 %), selbst bei einer hohen GO-Konzentration von 200 µg/ml. Bei s-GO wurde jedoch ein Verlust der Lebensfähigkeit bei 200 µg/mL beobachtet. Bei dieser Dosierung lag die Lebensfähigkeit der Zellen nach 24 Stunden Inkubation bei 67 %. Darüber hinaus wurde zur Bewertung der Zellsterblichkeit der Trypanblau-Ausschlusstest verwendet, bei dem die toten Zellen blau gefärbt wurden, während die lebenden Zellen unverändert blieben. Lebende Zellen weisen im Allgemeinen intakte Zellmembranen auf; Trypanblau kann ihre Membranen nicht durchdringen und in das Zytoplasma gelangen. Im Gegenteil, der Farbstoff durchdringt die poröse Zellmembran und gelangt in das Zytoplasma toter Zellen. Obwohl s-GO bei 200 µg/ml einen Verlust der Lebensfähigkeit bewirkt, wird keine Erhöhung der Sterblichkeit von A549-Zellen festgestellt. Die Sterblichkeit bleibt bei 1,5 % und ist damit ähnlich hoch wie bei der Kontrolle (1,4 %) (Abbildung 9). Bei der TEM-Untersuchung wurde ebenfalls keine zelluläre Aufnahme von GO durch die A549-Zellen festgestellt. In ähnlicher Weise berichteten Bengtson et al., dass GO und rGO unterschiedlicher Größe keine Toxizität in Lungenepithelzellen von Mäusen hervorrufen. [44,46]

Abbildung 8: Auswirkungen der Dosierung und Größe von Graphenoxid (GO) auf die Lebensfähigkeit von A549-Zellen. Wiedergegeben aus [46] mit Genehmigung von Elsevier. * und ** bezeichnen p < 0,05 bzw. p < 0,01 gegenüber der Kontrolle.
Abbildung 9 Die Auswirkungen der GO-Dosen und -Größen auf die Sterblichkeit von A549-Zellen. Wiedergegeben aus [46] mit Genehmigung von Elsevier.

Aus der Literatur geht hervor, dass GOs eine dosis- und größenabhängige Toxizität für verschiedene Zelllinien aufweisen, z. B. menschliche Fibroblasten, menschliche Leberzellkarzinome, menschliche Hautkeratinozyten usw. Wang et al. wiesen nach, dass GOs in Dosen <20 μg/mL keine toxische Wirkung haben, aber Dosen >50 μg/mL Zytotoxizität durch Induktion von Zellapoptose verursachen. Sie führten die Zytotoxizität auf das Eindringen von GOs in Lysosomen, Mitochondrien, Endoplasma und Zellkern zurück. Lammel et al. untersuchten die Auswirkungen der Exposition menschlicher Leberzellkarzinomzellen (HepG2) gegenüber GOs in Dosen von 1, 2, 4, 8 und 16 µg/mL. Es wurde eine dosis- und zeitabhängige Zytotoxizität in den HepG2-Zellen festgestellt, selbst bei einer niedrigen Konzentration von 4 µg/mL. Die GO-induzierte Toxizität ergab sich aus einem Verlust der strukturellen Integrität der Plasmamembran und einem Rückgang der MMP, was auf eine starke physikalische Wechselwirkung von GO mit der Phospholipid-Doppelschicht zurückzuführen ist. GO drang dann durch die Plasmamembran in das Zytosol ein, erzeugte ROS und verursachte eine erhöhte Anzahl apoptotischer Zellen. Kürzlich untersuchten Bernabo et al. die Lebensfähigkeit von Schweinespermien, indem sie sie 1 bis 4 Stunden lang 0,5-50 µg/mL GO aussetzten. Bei GO-Dosierungen ≥10 µg/mL trat der Zelltod nach 1 Stunde Exposition ein. Bei niedrigeren GO-Dosierungen wurde Cholesterin aus der Spermienmembran extrahiert, was zu einer Schädigung der Membran führte. [43,47,82,87,88]

Die Auswirkungen von GOs auf die Biokompatibilität/Toxizität von Immunzellen werden nun untersucht. Die Wechselwirkungen von GOs mit dem Immun- und dem Kreislaufsystem sind von entscheidender Bedeutung, da sie nach ihrer Verabreichung direkt mit diesen Systemen in Kontakt kommen. Makrophagen sind die Zellen, die an den Abwehrmechanismen des angeborenen Immunsystems beteiligt sind und eine erste Verteidigungslinie gegen Mikroorganismen bilden. Makrophagen entstehen aus Monozyten des Knochenmarks, die durch den Blutkreislauf wandern. In Gegenwart von Bakterien und Fremdkörpern sezernieren aktivierte Makrophagen Zytokine und Chemokine, um Zellen mit Chemokinrezeptoren, wie z. B. Neutrophile und Monozyten, aus dem Blutkreislauf anzulocken. Es wurden mehrere Studien über Makrophagen durchgeführt, die als Zielzellen für GOs fungieren. Reines Graphen und GOs induzieren die Bildung mehrerer proinflammatorischer Zytokine, einschließlich IL-1α, IL-6, IL-10 und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), und Chemokine, wie Monozyten-Chemoattractant-Protein-1 (MCP-1), Makrophagen-Entzündungsprotein-1α (MIP-1α) und MIP-1β bei Makrophagenaktivierung. Es ist bekannt, dass Makrophagen ein phagozytisches Verhalten zeigen, das zu einem Internalisierungsmechanismus führt. In dieser Hinsicht können GOs von Makrophagen internalisiert werden, was zu einer Entzündung führt. Russier et al. berichteten, dass die phagozytische Fähigkeit von Makrophagen von der Größe der GO-Flocken abhängt. [107-111]

Makrophagen sind eher in der Lage, kleinere GOs zu internalisieren als große. In ähnlicher Weise wiesen Ma et al. nach, dass kleine GOs mit einer lateralen Größe von 50-350 nm leicht von J774A.1-Makrophagen der Maus internalisiert werden, während große GOs (750-1300 nm) bevorzugt an deren Plasmamembranen adsorbiert werden und dadurch Toll-like-Rezeptor- (TRL) und Nuklearfaktor-NF-κB-Signalwege zur Förderung der Entzündungsbereitschaft auslösen. Große GOs können aufgrund ihrer großen Oberfläche eher mit der Zellmembran interagieren. Erst kürzlich untersuchten Mendes et al. die Auswirkungen der Größe von GOs auf die Lebensfähigkeit/Toxizität von Makrophagen und Gebärmutterhalskrebszellen HeLa (Abbildung 10). In ihrer Studie wurden GOs mit einer durchschnittlichen Größe von 89 und 277 nm verwendet. Sie fanden heraus, dass große GO-Flocken ein höheres Maß an Toxizität hervorrufen als kleine Flocken, insbesondere bei einer längeren Inkubationszeit von 48 Stunden (Abbildung 11). Die TEM-Untersuchung ergab, dass GOs unterschiedlicher Größe von Makrophagen (Abbildung 12) und HeLa-Zellen nach 12 und 48 Stunden Inkubation internalisiert werden. Insbesondere die Makrophagen erfuhren nach der 48-stündigen Kultivierung unabhängig von der Größe eine morphologische Veränderung für die Phagozytose. Diese morphologische Veränderung führte zur Bildung von großen Vakuolen, die GOs enthielten. [110,111]

Abbildung 10 Schematische Darstellung der Strategien zur Bewertung der größenabhängigen Zytotoxizität und Internalisierung von Nanographenoxid (NGO). Nachgezeichnet aus [111] mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry.
Abbildung 11 (a,c): 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Ergebnisse von HeLa-Zellen, die 12 h bzw. 48 h lang mit GOs unterschiedlicher Größe und Dosis kultiviert wurden. (b,d) sind die MTT-Ergebnisse von Makrophagen, die 12 h bzw. 48 h lang mit GOs unterschiedlicher Größe und Dosis kultiviert wurden. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; Balken ohne Markierung bedeuten ein nicht-signifikantes p > 0,05. Wiedergegeben aus [111] mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry.
Abbildung 12 (a,b) sind TEM-Bilder eines Makrophagen, der 12 bzw. 48 Stunden lang mit kleinen GOs kultiviert wurde. (c,d) sind TEM-Bilder eines Makrophagen, der 12 bzw. 48 Stunden lang mit großen GOs kultiviert wurde. GO-Flocken mit einer Größe von 89 und 277 nm werden von einem Makrophagen internalisiert, wie durch die Pfeile angezeigt. Reproduziert aus [111] mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry.

Wie bereits erwähnt, können GOs mit Zellmembranen interagieren und Schäden durch die Bildung von ROS, die Extraktion von Membranlipiden oder Cholesterinen und die Erzeugung von Kohlenstoffradikalen verursachen. Roten Blutkörperchen (Erythrozyten) mangelt es im Allgemeinen an Reparaturfähigkeit, da sie keinen Zellkern und keine Mitochondrien besitzen. Die Beschädigung der Membran von Erythrozyten wird als Hämolyse bezeichnet. Xia und Mitarbeiter wiesen darauf hin, dass die Lipidperoxidation zu einer Störung der Membranintegrität von Mäuse-Erythrozyten führen kann. Hydratisiertes GO führte zu einer stärkeren Hämolyse als GO und rGO. Liao et al. berichteten, dass GO (765 ± 19 nm) die hämolytische Aktivität menschlicher Erythrozyten aktivierten. Beschallte GOs mit einer geringeren Größe (342 ± 17 nm) wiesen eine höhere Hämolyserate auf als große GOs. Durch die Beschichtung der GO mit Chitosan wurde die hämolytische Aktivität jedoch nahezu aufgehoben. Somit beeinflusst die Art der Interaktion von GOs mit den Zellen (d. h. Suspension vs. adhärente Zellen) die Lebensfähigkeit von Erythrozyten. Kürzlich wiesen Papi et al. auch darauf hin, dass die hämolytische Aktivität menschlicher Erythrozyten mit abnehmender GO-Größe zunimmt. Diese Aktivität war vernachlässigbar, wenn das Plasmaprotein Corona an die GO-Oberflächen adsorbiert wurde. [45,87,112]

Abgesehen von den GO-Erythrozyten-Wechselwirkungen gibt es in der Literatur nur wenige Informationen über die toxische Wirkung von GO auf menschliche Primärzellen. Primäre Zellen werden direkt aus lebendem Gewebe gewonnen und für das Wachstum in vitro etabliert. Sie ahmen den physiologischen Zustand von Zellen in vivo nach und liefern nützlichere Ergebnisse, die das menschliche Körpersystem repräsentieren. Für die Gewinnung primärer menschlicher Zellen aus gesunden und kranken Organen ist eine ethische Genehmigung erforderlich. Vor kurzem untersuchten Wu et al. die Toxizität von GOs bei der Exposition gegenüber primären menschlichen Hornhautepithelzellen (hCorECs) und menschlichen Bindehautepithelzellen (hConECs) mit Dosen von 12,5-100 µg/mL. Aus den Daten des WST-8-Assays geht hervor, dass GOs bei hCorECs nach 2 Stunden keine Zytotoxizität auslösen (Abbildung 13A), mit Ausnahme einer erhöhten Nekrose auf der Grundlage des durchflusszytometrischen Apoptose-Nachweises bei 50 µg/mL (Abbildung 13C).

Allerdings verursachen GOs nach 24 Stunden eine signifikante Zytotoxizität für hCorECs. Die Lebensfähigkeit der Zellen nimmt mit steigender GO-Dosis deutlich ab (Abbildung 13B). Bei 50 µg/mL GO zeigt die Durchflusszytometrie einen deutlichen Anstieg der apoptotischen Zellen (Abbildung 13D). Im Fall von hConECs zeigt der WST-8-Assay, dass fast 40 % der hConECs tot sind, wenn sie 24 Stunden lang mit 12,5 µg/mL GO kultiviert werden. Die Lebensfähigkeit der Zellen beträgt nur 50 %, wenn die GO-Konzentration auf 100 µg/mL ansteigt (Abbildung 14A). Bei 50 µg/mL GO zeigt die Durchflusszytometrie, dass der Prozentsatz der normalen Zellen deutlich abnimmt, während der Prozentsatz der Nekrosezellen nach 24 Stunden Exposition deutlich ansteigt (Abbildung 14B). Sie schlussfolgerten, dass GOs dosis- und zeitabhängige Zytotoxizität sowohl in hCorECs als auch in hConECs durch die Erzeugung von oxidativem Stress durch die ROS-Detektion induzieren. [113]

Abbildung 13 WST-8-Assay-Ergebnisse für humane Hornhautepithelzellen (hCorECs), die (A) 2 Stunden bzw. (B) 24 Stunden lang GO in verschiedenen Dosen ausgesetzt waren. Apoptose-Durchflusszytometrie-Analyse von hCorECs, die GO (50 µg/mL) für (C) 2 h bzw. (D) 24 h ausgesetzt waren. Für beide Assays wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (Standardfehler des Mittelwerts) angegeben. * steht für p < 0,05 und ** für p < 0,01. Nachdruck aus [113] mit Genehmigung von Taylor & Francis.
Abbildung 14 (A) WST-8-Assay für hConECs, die 24 Stunden lang GOs in verschiedenen Dosierungen ausgesetzt waren. (B) Apoptose-Durchflusszytometrie-Analyse von hConECs, die 24 Stunden lang GO (50 µg/mL) ausgesetzt waren. Für beide Assays wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. * steht für p < 0,05 und ** für p < 0,01. Nachdruck aus [113] mit Genehmigung von Taylor & Francis.
PEGylierung

Graphenoxide können mit einer Vielzahl von Molekülen und Biomolekülen funktionalisiert werden, um ihre Dispergierbarkeit in physiologischen Lösungen und damit ihre Biokompatibilität zu verbessern. GOs werden in der Regel mit PEG, Amin, Acrylsäure und Dextran funktionalisiert. Insbesondere GO-PEG weist im Vergleich zu GO eine gute Biokompatibilität auf. Wojtoniszak et al. berichteten, dass PEGyliertes GO die beste Biokompatibilität mit der Fibroblasten-Zelllinie von Mäusen (L929) bei Dosierungen von 3,125-12,5 µg/mL aufweist. Die relative Lebensfähigkeit der Zellen liegt in diesem Dosisbereich bei über 80 %. Erhöht man die Dosis auf 50 µg/mL, sinkt die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich auf etwa 60 %, d. h. etwa 40 % der Zellen sind tot. Du et al. behandelten GO-PEG mit Lymphomzellen und untersuchten die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe des CCK-8-Tests. [48,114,115]

Zellen, die 24 Stunden lang mit GO-PEG (10-100 μg/mL) behandelt wurden, wiesen Lebensfähigkeitsraten von über 80 % auf, was auf eine geringe Zytotoxizität und hohe Biokompatibilität von PEG-GO schließen lässt. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass PEgylierte GO-Folien für einige Zelllinien zytotoxisch sind. So wurde beispielsweise festgestellt, dass GO-PEG-Folien die F-Actin-Filamente von Saos-2-Osteosarkom-Osteoblasten, MC3T3-E1-Präosteoblasten und RAW-264.7-Makrophagen nach der Internalisierung zerstören. Diese Filamente wurden für die Regulierung der Zellmigration benötigt. Die Unterbrechung führte bei diesen Zelllinien zu Zellzyklusveränderungen, Apoptose und oxidativem Stress. Kürzlich wiesen Mendonca et al. darauf hin, dass rGO-PEG in Astrozyten von Mäusen bei einer Konzentration von 100 µg/mL einen Überschuss an ROS induziert und die Lebensfähigkeit der Zellen nach 24 Stunden auf nur 16 % reduziert. Luo et al. wiesen nach, dass PEGylierte GO-Folien eine Immunantwort in peritonealen Makrophagen durch die Sekretion von Zytokinen zur Verstärkung von Integrin-beta-8-verwandten Signalwegen auslösen. Die PEGylierung wirkte also nicht passivierend auf die Oberflächen von Graphen-basierten Materialien. [116,117,118]

Kürzlich untersuchten Xu et al. die Lebensfähigkeit von Mäuse-Makrophagen (J774A.1), die mit GO, GO-NH2, poly(acrylamid)-funktionalisiertem GO (GO-PAM), poly(acrylsäure)-funktionalisiertem GO (GO-PAA) und GO-PEG in vitro und in vivo behandelt wurden. GO-PEG und GO-PAA erwiesen sich als weniger toxisch als GO, und GO-PAA zeigte in vitro (Abbildung 15) und in vivo die beste Verträglichkeit. Sie führten die Unterschiede auf die unterschiedlichen Zusammensetzungen der Proteinkorona, insbesondere von Immunglobulin G (IgG), zurück, die sich auf ihren Oberflächen bilden und die Wechselwirkungen mit der Zellmembran und die zelluläre Aufnahme bestimmen. Bekanntlich bedecken Proteine die Oberflächen von Nanomaterialien schnell, wenn diese Materialien mit einer physiologischen Umgebung in Kontakt kommen. Eine solche adsorbierte Proteinschicht wird gewöhnlich als Proteinkorona bezeichnet. In einer kürzlich von Syama et al. durchgeführten Arbeit wurde festgestellt, dass rGO-PEG (PrGO) in mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus dem Knochenmark von Mäusen keine Toxizität aufweist und ihre Differenzierung nicht zu beeinträchtigen scheint. PrGO wurde durch Reduktion von GO-PEG mit Natriumborhydrid hergestellt. [119,120]

PrGO wurde von MSCs internalisiert und im gesamten Zytoplasma verteilt. Obwohl es auch die Bildung von ROS innerhalb der Zelle induzierte, wurde keine Veränderung der Zellproliferation oder -funktion festgestellt. In einer anderen Studie zeigte PrGO eine dosisabhängige Abnahme der Lebensfähigkeit von A549-Alveolarepithelzellen nach 24-stündiger Exposition. Die Dosen reichten von 1-200 μg/mL. Der MTT-Test zeigte, dass mehr als 80 % der Zellen bei 10 μg/mL lebensfähig waren, aber die Lebensfähigkeit sank bei 25 μg/mL nach 24 Stunden auf unter 76 %. Der Neural Red Uptake (NRU)-Test zeigte ebenfalls eine ähnliche Abnahme der dosisabhängigen Zelllebensfähigkeit.

Darüber hinaus induzierte PrGO einen dosis- und zeitabhängigen Anstieg von ROS, reduzierte MMP und löste nach der Internalisierung eine Entzündungsreaktion aus, die zur Apoptose führte. MSCs und A549-Zelllinien reagierten also unterschiedlich auf PrGO, das mit denselben Verfahren hergestellt wurde. Im Gegensatz dazu wurde rGO von A549-Zellen nicht internalisiert, sondern blieb an der Plasmamembran haften. Als solches aktivierte es NF-κB durch Bindung an Zelloberflächen-TLRs und löste entsprechend eine Entzündungsreaktion aus. [121]

Abbildung 15 CCK-8-Testergebnisse von Makrophagenzellen (J774A.1), die 24 Stunden lang mit GO, GO-NH2, Poly(acrylamid)-funktionalisiertem GO (GO-PAM), Poly(acrylamid)-funktionalisiertem GO (GO-PAA) und Poly(acrylamid)-Polyethylenglykol (GO-PEG) in verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden (n = 5). Reproduziert aus [119] mit Genehmigung der American Chemical Society.
Reduziertes Graphen-Oxid

Akhavan et al. stellten rGO-Nanoplättchen durch Beschallung von PEGylierten GO-Schichten und anschließende Reduktion in Hydrazin und Rinderserumalbumin her. Der Test der Zelllebensfähigkeit zeigte, dass die Behandlung mit nur 1,0 μg/mL rGO zu einer signifikanten Zerstörung der Zellen in hMSCs führte. Die rGO-Nanoplättchen lösten durch DNA-Fragmentierung und Chromosomenaberrationen genotoxische Wirkungen auf die Zellen aus. Wie bereits erwähnt, ist Hydrazin hochgiftig und explosiv, so dass eine signifikante toxische Wirkung von Hydrazinresten auf der rGO-Oberfläche herrühren könnte. Für biomedizinische Anwendungen ist es notwendig, die toxischen Auswirkungen von Lösungsmitteln und Reduktionsmitteln zu berücksichtigen, die zum Ablösen der Graphenblätter verwendet werden. Viele dieser chemischen Reagenzien entsprechen nicht den Sicherheitsstandards. Wu et al. wiesen kürzlich nach, dass rGO toxischer ist als GO, wenn es Knochenmark-Makrophagen (BMDMs) und der J774A.1-Zelllinie ausgesetzt wird. In ihrer Studie verursachte rGO höhere Konzentrationen pro-inflammatorischer Zytokine, d. h. TNF-α und IL-6, in den Makrophagen, insbesondere in BMDMs. Sie führten dies darauf zurück, dass rGO im Vergleich zu GO einen höheren oxidativen Stress in den Makrophagen auslöst. Es sei darauf hingewiesen, dass sie Natriumsulfid (Na2S) zur Reduktion von GO verwendeten. Natriumsulfid ist ein giftiger Stoff, der beim Menschen schwere Hautreizungen oder Verbrennungen hervorruft, und reagiert mit feuchter Luft oder Säure zu giftigem H2S. Wir gingen davon aus, dass restliches Na2S in rGO proinflammatorische Zytokine induziert, die zur Aktivierung von Makrophagen führen. [122,123]

Um die durch Hydrazin verursachte Zytotoxizität zu bekämpfen, stellten Gurunathan et al. erfolgreich rGO her, indem sie einen Bakterienstamm, d. h. Pseudomonas aeruginosa, als Reduktionsmittel für GO verwendeten. Anschließend setzten sie primäre embryonale Mäusefibroblasten (PMEFs) unbehandeltem GO, mikrobiell reduziertem GO (M-rGO) und hydrazinreduziertem GO (H-rGO) in verschiedenen Konzentrationen aus. Die Ergebnisse des WST-8-Tests zeigen, dass die Lebensfähigkeit der Zellen bei der Behandlung von PMEFs mit 20-100 μg/ml M-rGO bei etwa 91,0 ± 2,0 % liegt (Abbildung 16a). H-rGO zeigt jedoch im Vergleich zu M-rGO ein signifikantes Maß an Toxizität. Die Lebensfähigkeit der Zellen sinkt durch die Behandlung mit 20 μg/mL H-rGO auf unter 60 %. Die Daten des Trypanblau-Tests zeigen auch, dass die Zellsterblichkeit bei der Behandlung mit einer hohen M-rGO-Konzentration (100 μg/mL) bei etwa 4 % liegt und damit derjenigen der Kontrolle entspricht (Abbildung 16b). Im Gegensatz dazu induziert H-rGO im Vergleich zu M-rGO die höchste Sterblichkeitsrate. Die Ergebnisse zeigen deutlich die toxische Wirkung von Hydrazin auf biologische Zellen. Obwohl Bakterienbiomasse GO reduzieren und die toxische Wirkung von rGO wirksam minimieren kann, ist ihre Verwendung für den biomedizinischen Bereich sehr begrenzt. Dies liegt daran, dass Pseudomonas aeruginosa Harnwegs- und Atemwegsinfektionen, Lungenentzündungen und Dermatitis verursachen kann. [124]

Abbildung 16 (a) WST-8-Assay für primäre embryonale Fibroblasten der Maus, die 24 Stunden lang GO, M-rGO und H-rGO in verschiedenen Konzentrationen ausgesetzt waren. Fehlerbalken stellen Standardfehler des Mittelwerts dar (n = 3); p < 0,05; (b) Zellsterblichkeit primärer embryonaler Fibroblasten der Maus (PMEF), bestimmt anhand des Trypanblau-Assays nach 24-stündiger Exposition gegenüber GO, M-rGO und H-rGO in verschiedenen Konzentrationen. Fehlerbalken stellen Standardfehler des Mittelwerts dar (n = 3); p < 0,05. Wiedergegeben aus [124] mit Genehmigung von Elsevier.

Kürzlich verwendeten Dasgupta et al. grün synthetisierte rGOs in verschiedenen Dosierungen (50, 100 und 250 µg/mL), um ihre Wechselwirkungen mit menschlichen Lymphozyten aus frischen Blutproben zu untersuchen. GOs wurden in einer Wildpilzextraktlösung reduziert, um rGOs zu erhalten. Für die In-vitro-Zelltests wurden verschiedene Assays verwendet, darunter MTT, Neuralrot-Aufnahme, Durchflusszytometrie und ROS. MTT-Daten zeigten keine signifikante Veränderung der mitochondrialen Aktivität. Der Neuralrot-Aufnahmetest (NRU) zeigte einen Verlust der lysosomalen Integrität bei rGO-Gehalten ≥100 μg/mL (Abbildung 17a). Die Durchflusszytometrie zeigte, dass die Aufnahme von Propidiumjodid (PI) beim höchsten rGO-Gehalt (250 μg/mL) deutlich ansteigt, was auf einen Verlust der Membranintegrität hindeutet (Abbildung 17b). Offensichtlich sind die grün synthetisierten rGOs weniger toxisch als die rGO-Gegenstücke, die mit einer konventionellen Strategie unter Verwendung toxischer Reduktionsmittel hergestellt wurden. [105]

Abbildung 17 (a) Neuralrot-Aufnahme und (b) Ergebnisse der Durchflusszytometrie (PI-Schätzung) für grün synthetisiertes rGO, das menschlichen Lymphozytenzellen ausgesetzt wurde. Wiedergegeben aus [105] mit Genehmigung der Public Library of Science.

In einer kürzlich von Mittal et al. durchgeführten Studie wurde festgestellt, dass GO bei Exposition gegenüber menschlichen Alveolarepithelzellen A549 und Bronchialepithelzellen (BEAS-2B) eine höhere Toxizität als rGO hervorrufen. Das Vorhandensein sauerstoffhaltiger Gruppen auf GOs führte aufgrund der Bildung von ROS und oxidativem Stress zu einem Anstieg der Zytotoxizität. In ähnlicher Weise wiesen Das et al. nach, dass GO bei Exposition gegenüber menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) toxischer ist als rGO derselben Größe. GO mit reichlich funktionellen Sauerstoffgruppen hat ein größeres Potenzial, mit Endothelzellen zu interagieren, was zu einem hohen ROS-Niveau und DNA-Schäden führt. Der oxidative Stress manifestiert sich in einer erhöhten Genexpression der Häm-Oxygenase 1 (HO1) und der zytosolischen Thioredoxin-Reduktase (TrxR). [125,126]

Sasidharan et al. untersuchten die Wirkung von TRG und Carboxyl-funktionalisiertem TRG (f-TRG) auf die Lebensfähigkeit von Vero-Nierenzellen von Affen. Die Messung des Kontaktwinkels ergab, dass TRG-Flocken hydrophob waren und einen großen Wasserkontaktwinkel von 162° aufwiesen, während f-TRG-Flocken aufgrund des Vorhandenseins von Carboxylgruppen hydrophil waren und einen Winkel von 30° aufwiesen. Es wurde festgestellt, dass sich die hydrophoben TRG-Flocken an der Plasmamembran anreichern, während die f-TRG-Flocken von den Zellen internalisiert werden, wie die konfokalen Fluoreszenzmikroskopbilder zeigen. Wie bereits erwähnt, können hydrophobe TRG starke Wechselwirkungen mit Membranlipiden hervorrufen, die zu einer direkten physikalischen Toxizität führen, z. B. zur Lipidextraktion. [127]

Die Lebensfähigkeit der Zellen nahm mit steigender TRG-Konzentration deutlich ab. Bei 100 mg/mL waren fast 50 % der Zellen tot, bei 300 mg/mL waren es etwa 60 %. Im Gegensatz dazu zeigten f-TRG-Proben vernachlässigbare Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, selbst bei einer hohen Konzentration von 300 mg/mL (Abbildung 18a). Trotz der Tatsache, dass f-TRG-Flocken von den Zellen internalisiert wurden, blieb ihre Stoffwechselaktivität unbeeinflusst. Abbildung 18b zeigt den zellulären LDH-Austritt aufgrund der TRG- und f-TRG-Exposition. Bekanntlich werden LDH-Moleküle aus Zellen mit beschädigter Membran in das Medium abgegeben. Daher ist der LDH-Spiegel im Kulturmedium ein Indikator für die Schädigung der Zellmembran. Bei 300 mg/mL verursachten TRG-Flocken einen vollständigen Zelltod, aber es kam zu keiner LDH-Freisetzung. Es ist unklar, wie f-TRG eine positive Wirkung auf die zelluläre Lebensfähigkeit haben könnte, und seine Carboxylgruppen interagieren nicht mit Vero-Zellen, wie dies bei GO (mit Carboxylgruppen) der Fall ist, das Wechselwirkungen mit menschlichen epithelialen Lungenzellen und HUVEC zeigt. Dieser Effekt könnte auf die unterschiedlichen Zelltypen und physiochemischen Eigenschaften von GO und f-TRG zurückzuführen sein. Tabelle 1 fasst die größen-, dosis- und zeitabhängige Toxizität zusammen, die von Graphen und seinen Derivaten bei der Exposition mit Säugetierzellen hervorgerufen wird.

Abbildung 18 (a) Zelllebensfähigkeit und (b) Laktatdehydrogenase (LDH)-Austritt von Vero-Zellen, die mit TRG und f-TRG in verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden. Wiedergegeben aus [127] mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry.

In-vivo-Tiermodell

Im In-vivo-System wird das gesamte lebende Tier verwendet, um die Auswirkungen der durch Nanomaterialien auf Graphenbasis verursachten Toxizität zu bewerten. Nützliche Informationen über die Wechselwirkungen zwischen Zellen und Graphen können durch histologische und mikroskopische Untersuchungen der relevanten Organgewebe und Entzündungszellen der Tiere nach oraler Fütterung, intravenöser Verabreichung, intraperitonealer Injektion (i.p.), intratrachealer Instillation, oropharyngealer Aspiration, subkutaner Injektion usw. gewonnen werden. Die In-vivo-Wirkung von GO und seinen Derivaten hängt stark von der chemischen Beschaffenheit der Nanomaterialien, der Expositionszeit, der Dosis und dem Verabreichungsweg sowie der Art der für die Tests verwendeten Tiere ab. Aus der frühen Studie von Yang et al. geht hervor, dass PEG-GO bei Mäusen nach intravenöser Verabreichung einer Dosis von 20 mg/kg über einen Zeitraum von drei Monaten keine nennenswerte Toxizität hervorrief. [48]

PEG-GO reicherte sich hauptsächlich in der Leber und der Milz an und wurde über die Nieren und den Kot ausgeschieden. In einer anderen Studie wurden balb/c-Mäusen 4 mg/kg GO durch i.p. und orale Verabreichung verabreicht und anschließend histologische und hämatologische Untersuchungen durchgeführt. Ihren Ergebnissen zufolge verbleiben GO nach i.p.-Injektion über einen langen Zeitraum im Mäusekörper, ihre Toxizität für die Mäuse war unbedeutend. Ali-Boucetta et al. wiesen darauf hin, dass gereinigtes GO bei Mäusen nach i.p.-Injektion keine Entzündungen und Granulombildung auslöste. In vivo-Studien anderer Wissenschaftler ergaben, dass GO bei Kaninchen keine Veränderungen des Augapfels und des Augeninnendrucks hervorrief, während Amino-GO bei Mäusen nach intravenöser Injektion keine pulmonale Thrombotoxizität auslöste. [128-131]

Im Gegensatz dazu erwies sich LPE-Graphen in Reinform als toxisch und verteilte sich hauptsächlich im Gehirn und in den Nieren von Hühnerembryonen. Dieses Ergebnis war nicht überraschend, da LPE-Graphen, wie bereits erwähnt, toxische Lösungsmittel- und Tensidrückstände enthält. Mehrere In-vivo-Studien an Mäusen ergaben, dass GO insbesondere bei hohen Konzentrationen eine Entzündungsreaktion, ein Lungenödem und die Bildung von Granulomen hervorruft. Darüber hinaus wurden in Lunge und Leber dosis-, größen- und zeitabhängige Entzündungen mit Zellinfiltration und Fibrose festgestellt. So berichteten Wang et al., dass GOs in niedriger (0,1 mg) und mittlerer Dosis (0,25 mg) nach intravenöser Injektion keine offensichtliche Toxizität bei Kunming-Mäusen (KM) aufwiesen. Bei einer hohen Dosis von 0,4 mg pro Tier wurde eine chronische Toxizität, wie der Tod der Mäuse und die Bildung von Lungengranulomen, beobachtet. Die Todesfälle traten 1-7 Tage nach der intravenösen Injektion auf. Darüber hinaus waren GOs hauptsächlich in der Lunge, der Leber und der Milz zu finden. Zhang et al. wiesen darauf hin, dass die In-vivo-Wirkung von GOs dosisabhängig ist. Bei einer Dosis von 1 mg/kg wurden bei Mäusen nach 14-tägiger intravenöser Injektion eine geringe Aufnahme in das retikulo-epitheliale System (RES) und keine pathologischen Veränderungen festgestellt. Bei einer Dosis von 10 mg/kg wurden jedoch eine Infiltration von Entzündungszellen, ein Lungenödem und die Bildung von Granulomen in der Lunge beobachtet. Ma et al. verabreichten 5 mg/kg Körpergewicht kleiner GOs (50-350 nm) und großer GOs (750-1300 nm) an männliche balb/c-Mäuse durch i.p. und intratracheale Instillation für drei Tage. [47,110,118,132-135]

Sie wiesen darauf hin, dass große GOs die Expression von Entzündungszytokinen in der Bauchhöhle und im Blut von Mäusen nach i.p.-Injektion erhöhten. Dies führte zu einer verstärkten Rekrutierung von Leukozyten in der Peritonealhöhle, was zu einer akuten Entzündung führte. Nach intratrachealer Instillation verursachten große GOs auch einen drastischen Anstieg der Produktion von pulmonalen und systemischen Entzündungszytokinen und der Rekrutierung von Entzündungszellen. In jüngerer Zeit injizierten Amrollahi-Sharifabadi et al. Wistar-Ratten GOs (5-10 μm) in Dosen von 50, 150 oder 500 mg/kg intraperitoneal. Die GOs gelangten zunächst ins Blut und lokalisierten sich dann in der Leber. Wie bekannt, ist Bilirubin ein Leberenzym, das als Biomarker für Leberschäden dienen kann. Die hämatologische Analyse ergab, dass GOs in einer Dosis von 500 mg/kg nach 21 Tagen zu einem signifikanten Anstieg des Bilirubinspiegels im Serum führten, was auf eine Lebertoxizität schließen lässt. Außerdem lösten GOs dosisabhängig Entzündungen und eine granulomatöse Reaktion aus. Xia und Mitarbeiter führten eine oropharyngeale Aspiration von GO, hGO und rGO bei C57BL/6-Mäusen durch. Sie berichteten, dass hydratisiertes GO toxischer ist als GO und rGO. hGO löste eine akute Lungenentzündung aus, begleitet von der höchsten Lipidperoxidation in alveolären Makrophagen und einer Zytokinproduktion aufgrund der Bildung von Kohlenstoffradikalen. [87,135]

Bei der In-vitro-Zellkultivierung induzierte GO-PEG Immunreaktionen durch Zytokinsekretion in murinen Makrophagen. Die PEGylierung hat also nicht zur Passivierung von GO-Oberflächen beigetragen. Es ist interessant zu wissen, ob GO-PEG-Folien in Tiermodellen in vivo toxische Wirkungen hervorrufen. Kürzlich verabreichten Xu et al. balb/c-Mäusen GO, GO-PEG, GO-PAA, GO-NH2 und GO-PAM in einer Dosierung von 0,05, 1, 5, 10 und 20 mg/kg Körpergewicht durch Injektion in die Nagelvene. Die Überlebensrate der Mäuse betrug bei diesen GO-Dosen 100 %, 80 %, 60 %, 20 % bzw. 0 %. Bei Mäusen, denen GO in einer Dosierung von 1 mg/kg für 1 Tag und 14 Tage verabreicht wurde, kam es zu einer erheblichen Verarmung der Blutplättchen im peripheren Blut. GO-PAM und GO-PEG verursachten ebenfalls eine eintägige Thrombozytendepletion, aber bei GO-NH2 und GO-PAA wurde keine Depletion festgestellt. GOs wurden hauptsächlich in der Lunge, der Milz und der Leber akkumuliert, wie die Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (LDIMS)-Analyse ergab (Abbildung 19a). [117,118,119]

Mit zunehmender GO-Dosis wurde die Lunge dunkler, was auf eine verstärkte Agglomeration und Akkumulation von GOs hindeutet (Abbildung 19b). Histologische Untersuchungen von Lunge und Milz wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Masson-Trichrom-Färbung durchgeführt (Abbildung 19c,d). Bei der H&E-Färbung wurden die Zellkerne mit Hämatoxylin blau gefärbt, während das Zytoplasma und die extrazelluläre Matrix mit Eosin rosa gefärbt waren. GO und GO-PAM verursachten schwerwiegende Lungenverletzungen, was sich in einer Verdickung der Alveolenwände aufgrund der Infiltration durch Entzündungszellen und einer Zunahme des Kollagens in den Bronchiolen zeigte. GO-PAA verursachte jedoch geringere Schäden in Lunge und Leber im Vergleich zu anderen Mäusen, die mit GO, GO-NH2, GO-PAM und GO-PEG behandelt wurden. Xu et al. führten diese Unterschiede auf die deutlichen Veränderungen des IL-6- und Kollagen-1-Gehalts aufgrund der Fibrose (Abbildung 19e,f) und auf die Zusammensetzung der Proteinkoronaden zurück. GO-PAA und GO-PEG enthielten einen geringeren Gehalt an Immunglobulin G in ihren Proteinkoronen (30-40 %) als GO, GO-NH2 und GO-PAM (50-70 %). Von diesen ist GO-PEG in vivo mäßig sicherer als GO, GO-PAA zeigt die beste Kompatibilität, und GO-PAM weist in vitro und in vivo die höchste Zytotoxizität auf.

Abbildung 19 (a) Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (LDIMS)-Bildanalyse, die die Biodistribution von GO in Mäusen zeigt, die einen Tag lang mit GO (2 mg/kg Körpergewicht) behandelt wurden. (b) Bilder der Lungen von Mäusen nach eintägiger Behandlung mit GO (0,05, 0,25, 0,5, 1 und 2 mg/kg Körpergewicht). Histologische Bilder von (c) mit H&E und Masson’s Trichrom gefärbten Lungen und (d) mit H&E gefärbten Lebern von Mäusen, die 14 Tage lang mit 1 mg/kg GO behandelt wurden. Die vergrößerten Bilder der Linienquadrate zeigen die vergrößerten Lungenbläschen. Die dunklen Flecken sind GO-Zellkomplexe in den Lebern. Bei der Masson-Trichrom-Färbung zeigt die blaue Farbe das Kollagen in der Lunge. (e) IL-6-Spiegel in Seren von Mäusen, die 1 Tag lang mit einer Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht behandelt wurden (n = 5). (f) Proteinmarker von Kollagen 1, Gr1, CD68 und CD11b, gemessen durch Western-Blot-Analyse in der Lunge von Mäusen, die 14 Tage lang mit 1 mg/kg Körpergewicht behandelt wurden. Die quantifizierten Daten sind im rechten Feld dargestellt (n = 4). * und ** bedeuten p < 0,05 und p < 0,005 im Vergleich zu PBS-behandelten Mäusen. Reproduziert aus [119] mit Genehmigung der American Chemical Society.

Syama et al. verabreichten Schweizer Albino-Mäusen PrGO (rGO-PEG) in einer Dosierung von 10 mg/kg Körpergewicht durch intraperitoneale und intravenöse Injektionen über 3, 7, 14 und 21 Tage. Zur Analyse der Biodistribution von PrGO wurde die konfokale Raman-Mikroskopie eingesetzt. Die Raman-Bildgebung von Blut, Urin, Knochenmark und anderen Organen am Ende der vorgeschriebenen Zeiträume zeigte das Vorhandensein von PrGO-Folien in Gehirn, Leber, Niere, Milz und Knochenmark. Die Urinanalyse ergab eine sehr schwache PrGO-Intensität, was auf eine geringe Ausscheidungsrate von PrGO über die Nieren hindeutet. Die Aufnahme von PrGO im Gehirn über beide Injektionswege zeigte, dass PrGO die Blut-Hirn-Schranke (BHS) überwinden und sich dann im Gehirn anreichern kann. Kürzlich verabreichten Shang et al. balb/c-Mäusen 4 mg/kg GOs durch i.p.-Injektion. Hohe ROS- und MDA-Werte aufgrund von Lipidperoxidation waren für die Schädigung von Gehirn und Nieren verantwortlich. Syama et al. wiesen auch nach, dass die Art der Injektion die Translokation von PrGO in den Organen von Mäusen beeinflusst. Intravenös injiziertes PrGO gelangte nach drei Tagen aus dem Blutkreislauf in Leber und Milz. Die maximale Aufnahme von PrGO wurde in Leber und Milz festgestellt, gefolgt von Niere und Gehirn. Bei i.p.-Verabreichung wurde PrGO zunächst in der Peritonealhöhle adsorbiert und reicherte sich dann in der Leber an. Die wiederholte Injektion von PrGO verursachte eine akute Leberschädigung und eine verstärkte Splenozytenproliferation. [23,136]

Die Splenozytenproliferation stimulierte die Reaktionen des Immunsystems aufgrund der Anwesenheit einer Vielzahl von Zelltypen mit unterschiedlichen Immunfunktionen, wie Makrophagen, dendritische Zellen, B-Zellen und T-Zellen in der Milz. In ähnlicher Weise berichteten Mendonca et al., dass rGO und rGO-PEG die BHS-Verbindung von Wistar-Mäusen infolge der Bildung von ROS und Lipidperoxidation schwächen. Erhöhte Werte der antioxidativen Enzyme Katalase, SOD-1 und reaktive Thiobarbitursäure-Substanzen im Hippocampus waren für die Entstehung von oxidativem Stress verantwortlich. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Oberflächenfunktionalisierung von GOs und rGOs mit PEG die durch Graphen verursachte Zytotoxizität nicht vollständig beseitigen kann. Um die biologischen Auswirkungen und die Sicherheit von Graphen-Nanomaterialien für den Menschen zu verstehen, sind weitere systematische Studien zur Toxizität und Biokompatibilität erforderlich, insbesondere in Tiermodellen. [117,137,138]

Aus den In-vivo-Tierstudien geht hervor, dass ROS und oxidativer Stress die Schlüsselfaktoren für die Schädigung von Zellmembranen bei der Exposition gegenüber GOs sind. Es ist bekannt, dass erhöhte ROS-Werte Lipide, Proteine und DNA stören können, was zu Membranschäden und schließlich zum Zelltod führt. Oxidativer Stress wird daher mit einer Vielzahl von pathologischen Anomalien und degenerativen Krankheiten in Verbindung gebracht, insbesondere mit Erythrozyten und Gehirnzellen, die am Sauerstofftransport und der aeroben Atmung beteiligt sind. Tabelle 2 enthält eine Liste von In-vivo-Studien, in denen die verschiedenen Verabreichungswege von Nanomaterialien auf GO-Basis und die damit verbundenen biologischen Auswirkungen zusammengefasst sind. [23,136,137,139-145]

GO-Polymer-Nanokompositen

GO lassen sich aufgrund der vorhandenen sauerstoffhaltigen Gruppen gut in Wasser dispergieren. Daher können hydrolytische Polymere, wie Polyvinylalkohol (PVA) und PEG, in wässriger Lösung leicht mit GO reagieren und Polymer-Nanokomposite bilden. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den sauerstoffhaltigen Gruppen von GO und PVA können die Aggregation von Füllstoffen verhindern und die Wechselwirkungen zwischen Polymer und Füllstoff fördern. Die mechanische Festigkeit von GO/PVA-Nanokompositen nimmt im Vergleich zum reinen Polymer deutlich zu, was auf den effektiven Mechanismus der Spannungsübertragung von der Polymermatrix auf die GO-Füllstoffe während des Zugversuchs zurückzuführen ist. Synthetische biologisch abbaubare Polymere wie Polymilchsäure (PLA), Polyglycolid (PGA) und Poly(milch-co-glycolsäure)-Copolymer (PLGA) finden nützliche Anwendungen im biomedizinischen Bereich, einschließlich der Verabreichung von Arzneimitteln und der Herstellung von Knochengewebe als Nahtmaterial und Gerüste. PLA ist ein hydrophobes Polymer, da es -CH3-Seitengruppen in seinen wiederkehrenden Einheiten enthält. Die Methylengruppen verleihen PLA eine langsame biologische Abbaugeschwindigkeit, geringe mechanische Festigkeit und Zähigkeit. Die geringe mechanische Festigkeit von PLA behindert seine Entwicklung für die Herstellung von Vorrichtungen zur internen Fixierung von Knochenbrüchen in der Orthopädie. [77,146,147,148]

Biologisch abbaubare Polymer-Fixierungsvorrichtungen haben einen deutlichen Vorteil gegenüber ihren metallischen Gegenstücken, da die Vorrichtungen im menschlichen Körper abgebaut werden können, so dass eine Revisionsoperation zu ihrer Entfernung nicht erforderlich ist. Dadurch werden die Schmerzen der Patienten, die an Knochenbrüchen leiden, und die Kosten für die Krankenhausversorgung erheblich reduziert. In den letzten Jahren ist die Zahl der Patienten, die an knochenbedingten Krankheiten wie Krebs und Knochenbrüchen leiden, aufgrund der Zunahme der älteren Bevölkerung und der Umweltverschmutzung weltweit stark angestiegen. Darüber hinaus verursachen auch Sport und Freizeitaktivitäten Knochenverletzungen bei Erwachsenen. Im biomedizinischen Sektor besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung fortschrittlicher Biomaterialien und polymerer Nanokomposite mit guter Biokompatibilität für Anwendungen im Bereich des Knochengewebes. In den letzten Jahren konzentrierte sich die Aufmerksamkeit auf die Verbesserung der Biokompatibilität und der mechanischen Eigenschaften von biologisch abbaubaren Polyestern, die mit GOs verstärkt sind. Die mechanischen Eigenschaften von PLA können durch die Zugabe von geringen GO-Gehalten verbessert werden. Dies liegt daran, dass GO mit einem höheren Elastizitätsmodul (207,6 ± 23,4 GPa) eine wirksame Verstärkung für PLA zur Bildung von Polymer-Nanokompositen darstellt. Darüber hinaus fördert GO auch die Adhäsion und Proliferation von Knochenzellen (Osteoblasten) sowie die Differenzierung von Stammzellen. In dieser Hinsicht sind GO/PLA-Biokomposite mit guter Biokompatibilität und Zugfestigkeit ideale Biomaterialien für die Entwicklung von Knochengewebe und Anwendungen in der regenerativen Medizin. [80,149-152]

Arriagada et al. untersuchten die Auswirkungen von GO- (0,5-5 Gew.-%) und TRG-Zusätzen (1-10 Gew.-%) auf die Biokompatibilität von schmelzgemischten GO/PLA- und PLA/TRG-Nanokompositen. Die menschliche Osteosarkom-Zelllinie (Saos-2) wurde auf diesen Nanokompositen kultiviert. Im Vergleich zu reinem PLA verbessert der Zusatz von nur 0,5 Gew.-% GO zu PLA die Lebensfähigkeit von Saos-2 von weniger als 70 % auf etwa 90 % (Abbildung 20). Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch Zugabe von 1 Gew.-% GO weiter verbessert werden. Dies liegt daran, dass hydrophiles GO die Proteinadsorption und die anschließende Zelladhäsion verbessern kann. Bei den PLA/TRG-Nanokompositen bleibt die Lebensfähigkeit von Saos-2 fast gleich mit der von reinem PLA, mit Ausnahme des PLA/1% TRG-Nanokomposits. Hydrophobes TRG verbessert die Adhäsion und Proliferation von Saos-2 nicht. [81]

Betrachtet man die mechanischen Eigenschaften, so steigt der Elastizitätsmodul von PLA durch Zugabe von 1 Gew.-% bzw. 2 Gew.-% GO von etwa 2,1 GPa auf 2,2 GPa bzw. 2,4 GPa, was einer Erhöhung der Steifigkeit um 4,8 % bzw. 14,3 % entspricht. In ähnlicher Weise fanden Pinto et al. heraus, dass GO die Adhäsion und Proliferation von Fibroblasten auf der Oberfläche von PLA/GO-Nanokompositfilmen verbessert. Es ist bemerkenswert, dass GO-Suspensionen mit scharfen Kanten die Zellmembran durchdringen und ins Zytoplasma gelangen können, was, wie bereits erwähnt, zu einem erhöhten ROS-Gehalt und schließlich zum Zelltod führt. Die Polymermatrix von Polymer-Nanokompositen kann jedoch die scharfen Kanten der GOs wirksam abdichten und so die Beschädigung der Zellmembran durch das Eindringen der GOs verhindern. Da die GOs fest an die Polymermatrix gebunden sind, können sie sich nicht frei bewegen, um eine Schädigung der Zellmembran und Apoptose zu verursachen. In dieser Hinsicht bieten GOs mit großer Oberfläche effektive Stellen für die Adhäsion und Proliferation von Osteoblasten während der Zellkultivierung. [15,153]

Abbildung 20 MTT-Ergebnisse für mit Saos-2 kultivierte PLA/GO- und thermisch reduzierte Graphenoxid/Polymilchsäure (PLA/TRG)-Nanokomposite. * bezeichnet die statistische Signifikanz zwischen den Versuchsgruppen und der Kontrolle. + bedeutet statistische Signifikanz zwischen den Versuchsgruppen und PLA (n = 6; p < 0,05). Wiedergegeben aus [81] mit Genehmigung von Wiley.

Herkömmliche Hydrogele, die mit Hilfe von organischen Vernetzern synthetisiert wurden, haben viele Nachteile, darunter schlechte Absorption, mechanische und strukturelle Eigenschaften. Hydrogele sind hydrophile, dreidimensionale Netzwerke aus Polymeren, die eine große Menge Wasser oder biologische Flüssigkeiten aufnehmen können und daher attraktive Anwendungen im Bereich des Tissue Engineering und der Arzneimittelverabreichung bieten. GO ist dafür bekannt, dass es aufgrund seiner zahlreichen hydrophilen Gruppen auf der Oberfläche eine wirksame Verstärkung für Hydrogelsysteme darstellt. GO kann daher starke Grenzflächenwechselwirkungen mit wasserlöslichen Polymeren (z. B. PVA, PEG und PAA) durch chemische oder Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. [154-162]

Zhang et al. stellten beispielsweise ein GO/PVA-Komposithydrogel her, das durch die Zugabe von 0,8 Gew.-% GO eine verbesserte Zugfestigkeit von 3,48 MPa aufwies, was einer Steigerung von 132 % gegenüber dem reinen PVA-Hydrogel entspricht. Dieses Nanokomposit-Hydrogel hatte eine nicht-toxische Wirkung auf Osteoblasten. Die Einführung von PEG könnte zu einer effizienteren Pfropfung von PVA-Molekülen auf der GO-Oberfläche führen. Dadurch wurde GO exfoliert und gleichmäßig in der PVA-Matrix von GO/PVA-PEG-Hydrogelen dispergiert. Zhong et al. stellten GO/PAA-Nanokomposit-Hydrogele mit einer Bruchdehnung von 2980 % und einer Zugfestigkeit von 777 kPa her, deren vernetztes Netzwerk durch physikalische Ionenvernetzung (Fe3+-Ionen) unterstützt wurde. Erst kürzlich haben Jing et al. selbstheilende rGO/PAA-Hydrogele hergestellt, die eine gute Biokompatibilität mit Fibroblasten und eine hohe Dehnbarkeit aufweisen und somit eine potenzielle Anwendung für künstliche Hautvorrichtungen darstellen. [157,159,161,162]

Schlussfolgerungen

In dieser Übersicht haben wir die Syntheseprozesse von Nanomaterialien auf Graphenbasis, ihre Biokompatibilität und Zytotoxizität zusammengefasst und diskutiert. Darüber hinaus wurde auch die In-vitro- und In-vivo-Zytotoxizität von Nanomaterialien auf Graphenbasis behandelt. Die größte Herausforderung bei der Kommerzialisierung von Graphen besteht heutzutage darin, qualitativ hochwertiges Graphen in großem Maßstab und zu niedrigen Kosten herzustellen. Die Qualität von Graphen spielt im biomedizinischen Bereich eine wichtige Rolle, da sich Verunreinigungen negativ auf Säugetierzellen auswirken können, indem sie Zellmembranschäden und Apoptose hervorrufen. Ein genaues Verständnis der direkten Wechselwirkungen zwischen nanostrukturiertem Graphen und Säugetierzellen kann durch die Verwendung von reinem Graphen gewonnen werden. Obwohl durch mechanische Exfoliation von Graphitflocken reines Graphen hergestellt werden kann, ist die Ausbeute für Zellmanipulationszwecke sehr gering. CVD-Graphen ist zu teuer und die Übertragung von einer Kupfer- oder Nickelfolie auf ein Glas- oder SiO2/Si-Substrat ist langwierig.

Dennoch liefert hochwertiges CVD-Graphen nützliche Informationen über seine Wechselwirkungen mit Zellen. Die meisten In-vitro-Zellkulturstudien haben gezeigt, dass CVD-Graphen im Nanomaßstab mit mehreren Zelllinien biokompatibel ist und insbesondere die Adhäsion von Fibroblasten und die Differenzierung von hMSCs in Knochenzellen fördert. Diese Ergebnisse sind ermutigend für mögliche Anwendungen von Graphen in der Orthopädie. Die Herstellung von LPE-Graphenblättern erfordert giftige Lösungsmittel und Tenside für die Graphitabscheidung. Diese chemischen Reagenzien, insbesondere die Tenside, lassen sich nur schwer aus den fertigen Graphenblättern entfernen, so dass die Verwendung von LPE-Graphen im biomedizinischen Bereich begrenzt ist. Ein typisches Beispiel ist die Zytotoxizität, die LPE-Graphen im Gehirn- und Nierengewebe von Hühnerembryonen hervorruft. [132]

Bislang werden GOs, die nach dem modifizierten Hummers-Verfahren hergestellt wurden, häufig zur Untersuchung ihrer Wechselwirkungen und Reaktionen mit Säugetierzellen in vitro und in vivo verwendet. In der Literatur finden sich widersprüchliche Ergebnisse über die Biokompatibilität und Zytoxizität von GOs und rGOs unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen. Dies hängt zum Teil damit zusammen, dass die Forscher verschiedene Oxidationszeiten, verschiedene Arten und unterschiedliche Konzentrationen von Oxidationsmitteln für die Synthese verwenden, was zu GOs führt, deren Struktur und Reaktivität sowie deren Verunreinigungsgrad von Studie zu Studie unterschiedlich sind. Die Vielfalt der strukturellen Eigenschaften hat einen großen Einfluss auf die Zell-GO-Wechselwirkungen. Darüber hinaus können die verschiedenen chemischen Oxidationsmittel und Reduktionsmittel, die zur Herstellung von GO und rGOS verwendet werden, metallische Verunreinigungen und organische Verunreinigungen erzeugen, die ihre Wechselwirkungen mit Zellen, Geweben und Organen verändern und zu Zellschäden und Apoptose führen.

Insbesondere das toxische Reduktionsmittel Hydrazin führt bei sehr geringem rGO-Gehalt (1,0 μg/mL) zu einer erheblichen Zellzerstörung in hMSCs, während Na2S-Rückstände in rGO ernsthafte entzündungsfördernde Reaktionen in Makrophagen auslösen. Diese nachteiligen Wirkungen können teilweise die Diskrepanzen zwischen den in der Literatur berichteten experimentellen Ergebnissen erklären. GOs und rGOs, die auf dem grünen Syntheseweg hergestellt wurden, sind vielversprechende Nanomaterialien für biomedizinische Anwendungen, da sie die Zytotoxizität in geringem Maße reduzieren können. [105,122,133]

Es wird davon ausgegangen, dass die Toxizität von GOs/rGOs minimiert werden kann, indem sie in Polymeren dispergiert werden, um Polymer-Nanokomposite zu bilden. So werden Graphen-Nanomaterialien immobilisiert, da sie fest an die Polymermatrix von Nanokompositen gebunden sind. Darüber hinaus kann die Polymermatrix die scharfen Kanten der GOs/rGOs versiegeln und ihr Eindringen in das Zytoplasma verhindern. So bieten Graphen-Nanofüllstoffe mit großer Oberfläche effektive Stellen für die Zelladhäsion und -proliferation, insbesondere für Osteoblasten (Knochenzellen). Darüber hinaus können sauerstoffhaltige Gruppen von GOs die Hydrophobie der Polymermatrix verringern, was die Anhaftung und Ausbreitung von Zellen auf der Polymeroberfläche ebenfalls erleichtert. Dieser Ansatz eröffnet neue Möglichkeiten für biomedizinische Anwendungen von Graphen-Nanomaterialien in der Orthopädie zur Herstellung fortschrittlicher Knochenfixierungsvorrichtungen, Gerüste und Implantate. Weitere Sicherheitsbewertungen und Forschungsarbeiten müssen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass diese Polymer-Nanokomposite vor der klinischen Anwendung mit menschlichem Gewebe biokompatibel sind. [15,16]

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Ncbi.Nlm.Nih, 31.12.2021